侯 魁，丁 軻,1b，劉守業(yè)，余祖華，趙戰(zhàn)勤

(1.河南科技大學(xué) a.河南省動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室；b.宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471023；2.大石橋市高坎動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 營口 115112)

副豬嗜血桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立

侯 魁1a，丁 軻1a,1b，劉守業(yè)2，余祖華1a，趙戰(zhàn)勤1a

(1.河南科技大學(xué) a.河南省動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室；b.宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471023；2.大石橋市高坎動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 營口 115112)

為了建立一種簡便、快速、靈敏、特異的副豬嗜血桿菌(Hps)檢測方法，以Hps的16S rRNA保守區(qū)域片段為靶序列，選擇6個特異性區(qū)域，設(shè)計4條特異性引物F3、B3、FIP和BIP。經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系、檢測靈敏性和特異性，建立Hps的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)快速檢測方法。研究結(jié)果表明：該方法的最優(yōu)反應(yīng)體系是引物c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)為1∶4、Mg2+濃度為2 mmol/L、dNTPs濃度為6 mmol/L，最低檢出量為0.241 pg/μL DNA。該方法靈敏度是PCR法的100倍，且能夠特異性檢測出Hps，不能檢測出豬鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和金黃色葡萄球菌。

副豬嗜血桿菌；16S rRNA；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；靈敏性；特異性

0 引言

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是豬上呼吸道中常在的一種機會致病菌，在特定條件下能夠侵入機體，引發(fā)以纖維素性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和漿膜炎為主要特征的全身性疾病[1]。規(guī)?；B(yǎng)殖模式使養(yǎng)殖密度增加，病毒性疾病的流行加重了副豬嗜血桿菌的繼發(fā)感染，導(dǎo)致仔豬死淘率增加、育肥豬生長性能下降，成為患病豬群的重要繼發(fā)病原之一[2-3]。因此，建立快速準確的診斷方法，及時采取相應(yīng)的防治措施是控制副豬嗜血桿菌感染的關(guān)鍵。

目前，對副豬嗜血桿菌的檢測主要是采用病原的分離與培養(yǎng)、血清學(xué)方法和常規(guī)的分子生物學(xué)方法[3-4]。但因副豬嗜血桿菌營養(yǎng)要求高，分離難度較大，尤其是抗生素的使用加大了副豬嗜血桿菌的分離難度。血清學(xué)檢測需要昂貴的試劑盒和專用的酶標(biāo)儀。常規(guī)的聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測方法需要昂貴的儀器，不適于副豬嗜血桿菌的臨床快速診斷。本文通過比對Hps 16S rRNA序列，獲得其高度保守區(qū)域，以此為靶基因，針對其6個特異性區(qū)域設(shè)計4條環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系，驗證其靈敏度和特異性，建立了能夠快速檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

副豬嗜血桿菌標(biāo)準菌株、豬鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、金黃色葡萄球菌等菌株，均由河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實驗室提供并保存。

BstDNA聚合酶大片段購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(soybean-casein digest agar medium,TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基均購自英國OXOID公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；Goldview核酸染料和SYBR GreenⅠ核酸凝膠染料均購自北京索萊寶公司；dNTP mixture(25 mmol/L)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；rTaqDNA聚合酶、dNTP mixture(2.5 mmol/L)、10×PCR buffer(Mg2+)等PCR用試劑均購自大連寶生物公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；基因擴增熱循環(huán)儀，西安天隆科技有限公司；DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；雙人凈化工作臺，浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Hps 16S rRNA序列，采用DNAStar 6.0軟件確定Hps 16S rRNA的高度保守區(qū)域。根據(jù)LAMP引物設(shè)計的原則，利用Primer Premier 6.0軟件，針對其6個特定區(qū)域，設(shè)計出4條特異性引物F3、B3、FIP和BIP，另設(shè)計副豬嗜血桿菌通用PCR引物P1、P2，引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 Hps基因組的提取

按照天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取Hps基因組。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

副豬嗜血桿菌LAMP反應(yīng)的體系為25 μL，其中：10×ThermoPol緩沖液2.5 μL(20 mmol/L Tris-HCL，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100(pH8.8))；BstDNA聚合酶大片段1 μL；DNA模板2 μL。分別對內(nèi)外引物濃度比(c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP))、Mg2+濃度、dNTPs濃度進行優(yōu)化，其中：引物濃度比以1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10進行優(yōu)化；Mg2+以終濃度0 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L進行優(yōu)化；dNTPs以終濃度0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L 進行優(yōu)化。體系在63 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h后，80 ℃高溫滅活20 min。反應(yīng)后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，在質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠中電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察優(yōu)化結(jié)果并保存。

1.2.4 LAMP反應(yīng)的敏感性檢測

用核酸測定儀測定Hps基因組的濃度，將原基因組以10倍梯度稀釋。以不同濃度的基因組作為模板，分別進行PCR反應(yīng)和LAMP反應(yīng)，比較兩種反應(yīng)的靈敏度。PCR反應(yīng)體系為：0.5 μL rTaqDNA聚合酶、2.5 μL 10×PCR buffer(Mg2+)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、上下游引物P1、P2各1 μL，加無菌水至 25 μL。PCR反應(yīng)的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5 LAMP反應(yīng)的特異性試驗

分別以副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、金黃色葡萄球菌基因組為模板，按照已建立的LAMP方法對其進行檢測，反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL SYBR Green Ⅰ核酸凝膠染料混勻，觀察顏色變化，各取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證所建立檢測方法的特異性。判定標(biāo)準為：反應(yīng)液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)梯狀條帶者為陽性反應(yīng)，無條帶者為陰性反應(yīng)；向反應(yīng)液中加入SYBR Green Ⅰ核酸凝膠染料混勻后，呈綠色者為陽性反應(yīng)，呈橙色者為陰性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

對LAMP法檢測Hps分別進行內(nèi)外引物濃度比(c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP))、Mg2+濃度、dNTPs濃度的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見圖1～圖3。優(yōu)化結(jié)果顯示：引物濃度比為1∶4時出現(xiàn)最清晰的條帶(見圖1)。Mg2+終濃度在2 mmol/L時能夠出現(xiàn)典型的梯狀條帶，終濃度為6 mmol/L時條帶最亮，過高的Mg2+濃度會影響電泳結(jié)果(見圖2)。dNTPs在2 mmol/L即可出現(xiàn)清晰度高、層次分明的梯狀條帶(見圖3)。

M.DL 2000 DNA Marker；1～6.引物濃度比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10；7.陰性對照。 圖1 LAMP反應(yīng)引物濃度比優(yōu)化結(jié)果

2.2 PCR法和LAMP法敏感性檢測結(jié)果

對Hps基因組進行10n倍(n=0,1,…,8)稀釋后，分別進行PCR和LAMP反應(yīng)，通過比對檢測其敏感性，檢測結(jié)果見圖4。圖4a顯示PCR法最低可以檢測到10-4倍的模板量，而圖4b顯示LAMP法最低可以檢測到10-6倍的模板量，是PCR法靈敏度的100倍。用核酸測定儀檢測到原模板的DNA質(zhì)量濃度為241 ng/μL，計算得LAMP法檢測Hps的DNA最低檢出量為0.241 pg/μL。

M.DL2000DNAMarker;1～6.Mg2+終濃度分別為0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L;7.陰性對照。圖2 LAMP反應(yīng)Mg2+終濃度優(yōu)化結(jié)果 M.DL2000DNAMarker;1～6.dNTPs終濃度分別為0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L;7.陰性對照。圖3 LAMP反應(yīng)dNTPs終濃度優(yōu)化結(jié)果

(a) PCR法敏感性檢測結(jié)果(b) LAMP法敏感性檢測結(jié)果M.DL2000DNAMarker;1～9.模板稀釋倍數(shù)分別為100、101、102、103、104、105、106、107、108倍;10.陰性對照。

圖4 PCR法和LAMP法敏感性檢測結(jié)果

2.3 LAMP法特異性檢測結(jié)果

利用本文所建立的方法，分別對副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和金黃色葡萄球菌進行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：僅在以副豬嗜血桿菌為模板時結(jié)果顯示有梯狀條帶，電泳呈陽性；且加入SYBR Green Ⅰ 核酸凝膠染料后僅副豬嗜血桿菌反應(yīng)液呈綠色，為陽性反應(yīng)，其他菌株反應(yīng)液呈橙色，為陰性反應(yīng)，表明所建立的LAMP方法具有良好的特異性。

3 討論

副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)過程中對營養(yǎng)和環(huán)境要求較高，從病料中分離率極低，一般條件下難以對其進行分離培養(yǎng)，且菌種保藏要求苛刻，甘油生理鹽水保藏15 d后存活率僅為1.3%[5]。最常用的瓊脂擴散試驗、間接血凝試驗等血清學(xué)診斷方法操作繁瑣，檢測所需時間長，且特異性和靈敏性較低[6]。PCR檢測方法雖然特異性強、靈敏度高，但是需要昂貴的PCR儀，不適合臨床及基層推廣使用。本文基于Hps 16S rRNA特異性片段設(shè)計引物，利用LAMP法檢測副豬嗜血桿菌，克服了這些缺點，其靈敏度是PCR法的100倍，DNA最低檢出量為0.241 pg/μL，反應(yīng)過程均在水浴鍋內(nèi)完成，操作簡便，非常適合基層及現(xiàn)場的快速診斷，為LAMP的基層推廣以及副豬嗜血桿菌的臨床診斷提供了重要的理論依據(jù)。與文獻[7-8]相比，本文所得到的試驗結(jié)果具有更加清晰的梯狀條帶，且各梯度之間差異顯著，能夠更加直觀地體現(xiàn)最佳反應(yīng)條件，確保所建立體系的準確性。

M.DL 2000 DNA Maker；1～7.模板分別為副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、金黃色葡萄球菌；8.陰性對照。圖5 LAMP法特異性檢測結(jié)果

LAMP技術(shù)自2000年由文獻[9]報道以后就吸引了世界各個領(lǐng)域的科研人員，目前LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細菌、病毒、寄生蟲等的檢測中，包括沙門氏菌、霍亂弧菌、乙型肝炎病毒、日本血吸蟲等[10-13]。而且，由于LAMP技術(shù)高特異性和高靈敏性的特點，科研人員將多種技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合，開發(fā)出新型LAMP技術(shù)用于生物學(xué)檢測。文獻[14]利用RT-LAMP技術(shù)快速檢測H1N1流感病毒。文獻[15]將LAMP和原位雜交相結(jié)合，建立Situ-LAMP技術(shù)，用于檢測組織細胞中攜帶stx2基因的細菌。LAMP技術(shù)研究前景廣闊，但研究中發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)也存在很多不足之處，如LAMP反應(yīng)的靶序列一般在300 bp以下，且內(nèi)引物終濃度較高，所以LAMP引物的設(shè)計和篩選工作相當(dāng)繁瑣，這也增大了其多重擴增的難度。另外，LAMP反應(yīng)靈敏度較高，在試驗過程中極易出現(xiàn)假陽性，因此應(yīng)嚴格區(qū)分試劑存放區(qū)、加樣區(qū)和檢測區(qū)，試驗器材應(yīng)嚴格消毒，并且要避免無關(guān)人員流動，在無菌操作臺內(nèi)完成加樣工作，一旦發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)暫時停止試驗、保持室內(nèi)通風(fēng)并更換所有試劑。

4 結(jié)論

建立了副豬嗜血桿菌的LAMP 檢測方法，確定了LAMP最佳反應(yīng)體系：內(nèi)外引物濃度比c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)為1∶4，Mg2+終濃度為6 mmol/L，dNTPs終濃度為2 mmol/L，加入10×ThermoPol緩沖液2.5 μL、BstDNA聚合酶大片段1 μL以及適量DNA模板，加無菌水至25 μL。在63 ℃水浴鍋中保溫1 h，然后80 ℃高溫滅活20 min即可完成反應(yīng)。該方法檢測副豬嗜血桿菌的最低檢出量為0.241 pg/μL DNA。反應(yīng)產(chǎn)物加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸凝膠染料變?yōu)榫G色或電泳結(jié)果出現(xiàn)梯狀條帶為陽性，反應(yīng)產(chǎn)物加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸凝膠染料變?yōu)槌壬螂娪窘Y(jié)果沒有出現(xiàn)梯狀條帶為陰性。

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國家“十三五”重點研發(fā)計劃基金項目(2016YFD0500700)

侯魁(1991-)，男，河南三門峽人，碩士生;丁軻(1977-)，男，通信作者，河南永城人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物微生態(tài)與動物傳染病方面的研究.

2017-03-02

1672-6871(2017)06-0059-04

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.06.012

S852.659.2

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