□ 楊若松 祁曉萌 熊雅婷 北京維德維康生物技術(shù)有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征病毒間接ELISA檢測方法的建立

□ 楊若松 祁曉萌 熊雅婷 北京維德維康生物技術(shù)有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS）又名“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種主要以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬呼吸道癥狀及高死亡率為特征的高度接觸性傳染病[1]。PRRS于1987年在美國首次發(fā)現(xiàn)，1991年荷蘭中央獸醫(yī)研究所首次分離得到病毒，我國在1996年首次報(bào)道[2]。

在我國，豬群感染PRRSV后出現(xiàn)混合感染、繼發(fā)感染的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，這與PRRSV的感染機(jī)制有關(guān)。PRRSV感染機(jī)體后以機(jī)體免疫系統(tǒng)細(xì)胞為靶細(xì)胞，從而抑制免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致其他病原極易乘虛而入。無論感染了傳統(tǒng)PRRSV還是高致病性PRRSV，被感染的豬均會(huì)表現(xiàn)出豬呼吸障礙等多種癥狀，臨床上多與副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、支原體等有關(guān)。試驗(yàn)證明，高致病性PRRSV感染可以加劇副豬嗜血桿菌感染，引發(fā)嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)[3]。

由于PRRSV可在宿主體內(nèi)的巨噬細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致無癥狀的持續(xù)感染。該病毒通過鼻黏膜和上呼吸道上皮細(xì)胞進(jìn)入宿主體內(nèi)，并在鼻黏膜、呼吸系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞以及淋巴組織中進(jìn)行原發(fā)性復(fù)制。隨后通過血液循環(huán)到達(dá)繼發(fā)性復(fù)制部位，如大腦、心、肺、胸腺、脾、肝、淋巴結(jié)、腎、腎上腺、小腸、睪丸等。病毒可進(jìn)入易感妊娠母豬體內(nèi)，跨越胎盤感染胎兒。

PRRS血清學(xué)診斷方法是應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物疫病診斷方法。關(guān)于PRRSV的血清學(xué)診斷，國內(nèi)外己建立了多種檢測PRRSV抗體的方法，主要有免疫過氧化物酶單層實(shí)驗(yàn)（immuno peroxidase monolayer assay，IPMA）[4]、間接免疫熒光檢測方法（indirect immunoin fluscent assay，IFA）[5]、血清中和試驗(yàn)（Serum Neutralization，SN）[6]以及酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。目前許多國家己把酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為PRRS日常監(jiān)測和臨床診斷的常規(guī)手段，因其抗原用量很少，檢測過程依靠儀器自動(dòng)化，故而適合大規(guī)模的快速檢測。

核衣殼蛋白N作為PRRSV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，是該病毒ELISA診斷方法中應(yīng)用最多的靶抗原[7]。間接ELISA方法是利用酶標(biāo)記的二抗（辣根過氧化物酶HRP標(biāo)兔抗豬IgG）以檢測與固相PRRSV抗原結(jié)合的PRRSV受檢抗體，故稱為間接法。間接法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷，此法與直接法類似，區(qū)別在于把沒有酶標(biāo)記的一級(jí)抗體改用酶標(biāo)記過的二級(jí)抗體去辨識(shí)一級(jí)抗體來測定抗原量。其優(yōu)點(diǎn)在于利用二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，只需通過變換包被的抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相對(duì)應(yīng)抗體的方法，完成不同的測定分析[8]。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

1 材料與方法

1.1 材料

重組PRRSV-N蛋白、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗豬IgG、176份豬血清。

1.2 方法

包括對(duì)蛋白質(zhì)包被濃度、包被緩沖液、封閉液、封閉條件、稀釋倍數(shù)、作用時(shí)間及溫度、以及最佳顯色時(shí)間及溫度等指標(biāo)的確定。

2 方法驗(yàn)證

2.1 特異性試驗(yàn)

用建立的PRRSV-N ELISA檢測方法分別檢測豬瘟陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、豬乙型腦炎病毒陽性血清、豬細(xì)小病毒陽性血清。計(jì)算S/P值，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

用同批次抗原包被酶標(biāo)板檢測同一份血清抗體來檢測板間與板內(nèi)變異及批間差異，計(jì)算同一份檢測樣本陽性百分率的變異系數(shù)(C.V.=S/X×100%，S：標(biāo)準(zhǔn)差，X：算術(shù)平均值)，以檢驗(yàn)板內(nèi)和板間檢測樣品的重復(fù)性。

2.3 與商品化試劑盒的對(duì)比

用本試驗(yàn)建立的PRRSV-N抗體ELISA檢測方法對(duì)美國IDEXX公司PRRSV抗體間接ELISA試劑盒檢測過的179份血清進(jìn)行檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 蛋白質(zhì)最佳包被濃度確定的結(jié)果

通過對(duì)4個(gè)濃度包被的酶標(biāo)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明PRRV-N蛋白稀釋到1g/mL時(shí)，樣本的P/N值最大，效果最好。在所建立的ELISA檢測方法中，確定包被抗原濃度為1g/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 抗原包被濃度測定結(jié)果

3.2 最佳包被緩沖液確定的結(jié)果

利用3種包被緩沖液包被抗原，通過實(shí)驗(yàn)，最終得出0.05moL/L碳酸鹽緩沖液的P/N在3種包被緩沖液中最大、最適于本方法中的抗原包被，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 包被緩沖液選擇結(jié)果

3.3 最佳封閉液確定的結(jié)果

通過8種封閉液對(duì)包有抗原的酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，實(shí)驗(yàn)最終確定封閉液為5%脫脂乳，P/N值最大且陽性值接近1.0、陰性值小于0.2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 最佳封閉液選擇結(jié)果

3.4 最佳封閉條件確定的結(jié)果

通過在不同溫度下封閉，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果為25℃條件下P/N值最大且陽性血清OD值與陰性血清OD值之差較大，最適合封閉，封閉條件為25℃反應(yīng)2h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 確定封閉條件結(jié)果

3.5 被檢血清最佳稀釋倍數(shù)確定的結(jié)果

通過倍比稀釋的方法對(duì)同種血清稀釋5個(gè)倍數(shù)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明按照1:40的比例被稀釋時(shí)樣本P/N值最大，被檢血清稀釋倍數(shù)為40倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

3.6 被檢血清最佳作用時(shí)間及溫度確定的結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出被檢血清在25℃反應(yīng)30min和45min的陰陽性血清OD值和P/N值幾乎一樣且最高，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，將被檢血清的作用時(shí)間及溫度定為25℃反應(yīng)30min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表6。

表5 被檢血清稀釋倍數(shù)確定結(jié)果

表6 被檢血清作用時(shí)間及溫度結(jié)果

3.7 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度確定的結(jié)果

通過倍比稀釋的方法將羊抗豬稀釋為不同濃度的酶標(biāo)抗體工作液并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)確定最佳酶標(biāo)抗體工作濃度為1:20000稀釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 最佳酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇結(jié)果

3.8 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間及溫度確定的結(jié)果

通過對(duì)不同酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間及溫度的測定，試驗(yàn)確定最佳酶標(biāo)抗體作用時(shí)間為25℃反應(yīng)30min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間及溫度測定結(jié)果

3.9 最佳顯色時(shí)間及溫度確定的結(jié)果

通過對(duì)不同顯色時(shí)間溫度的測定，試驗(yàn)確定最佳顯色條件為25℃顯色10min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 最佳顯色時(shí)間及溫度測定結(jié)果

3.10 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用建立好的ELISA方法檢測其他4種常見的豬傳染病陽性血清，結(jié)果均為陰性，PRRSV-N包被抗原與4種常見的豬傳染病陽性血清無交叉反應(yīng)，表明以重組PRRSV-N蛋白為包被抗原檢測PRRSV抗體的間接ELISA擁有良好的特異性，檢測結(jié)果見表10。

表10 PRRSV-N抗體間接ELISA特異性檢測結(jié)果

3.11 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用同批次抗原包被酶標(biāo)板檢測同一份血清抗體來判定板間與板內(nèi)的變異及批間差異，結(jié)果顯示：批內(nèi)板間與板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)都在3.22%～7.86%之間；批間變異系數(shù)在11.57%，前者小于10%，后者小于20%，表明此間接ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)穩(wěn)定性。

3.12 間接ELLSA方法與同類商品化試劑盒的對(duì)比

通過對(duì)建立的PRRSV-N抗體ELISA試劑盒與美國IDEXX-ELISA試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較分析，證明PRRSV-N抗體ELISA試劑盒與美國IDEXX-ELISA試劑盒的符合率比較好，總體符合率達(dá)到85.22%，敏感性85.83%，特異性83.93%，可用于PRRSV-N抗體的臨床檢測，比較結(jié)果見表11。

表11 PRRSV-N抗體間接ELISA與商品化試劑盒的比較結(jié)果

4 討論

本研究中將PRRSV-N蛋白用0.05moL/L碳酸鹽緩沖液稀釋到1g/mL后，進(jìn)行包被（4℃，16h）。用0.5%脫脂乳在25℃條件下進(jìn)行封閉2h，節(jié)省了抗原的使用量，并且在封閉時(shí)節(jié)約了時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本。酶標(biāo)抗體稀釋20000倍，在室溫（25℃±2℃）下反應(yīng)30min，較為節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，并且具有良好的敏感性和特異性。本實(shí)驗(yàn)與國外同類型試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，陰性符合率為83.93%，陽性符合率為85.83%，總符合率為85.22%。說明本實(shí)驗(yàn)建立的豬繁殖與呼吸綜合征病毒間接ELISA檢測方法具有較好的特異性和靈敏性，為下一步豬繁殖與呼吸綜合征試劑盒調(diào)試和生產(chǎn)提供了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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