楊朋飛 常曉嬌 伍松陵 王 峻 王楠希 屈凌波 孫長(zhǎng)坡

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1，鄭州 450001) (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院3，鄭州 450001)

一株伏馬毒素降解菌的篩選與鑒定

楊朋飛1,2常曉嬌2,3伍松陵2王 峻2王楠希2屈凌波1孫長(zhǎng)坡2

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1，鄭州 450001) (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院3，鄭州 450001)

以伏馬毒素FB1為唯一碳源，采用富集培養(yǎng)法從污泥樣品中分離到1株高效降解FB1的菌株。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)，該菌在液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)中對(duì)FB1有良好的削減能力，5 d內(nèi)可將25 μg的FB1完全降解。通過(guò)對(duì)該菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，并結(jié)合生理生化試驗(yàn)，最終鑒定為鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)，命名為ASAG22。ASAG22細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性物質(zhì)將FB1降解為4種質(zhì)荷比分別為406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9的新物質(zhì)，且該活性物質(zhì)經(jīng)蛋白酶K處理而失去活性。

伏馬毒素 鞘氨醇盒菌 生物降解

伏馬毒素(Fumonisins，F(xiàn)B)主要是串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)，多育鐮刀菌(F.proliferatum)，輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)和花腐鐮孢菌(F.anthophilum)等鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性次級(jí)代謝物[1]。1988年，由Gelderblom從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出，至今共發(fā)現(xiàn)FB1(相對(duì)分子量721.83，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1)、FB2和FB3等28種伏馬毒素[2]。其中，F(xiàn)B1的占比最高(約70%)，污染范圍最廣，毒性也最強(qiáng)。

圖1 FB1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

伏馬毒素主要存在于玉米、小麥、豆類等谷物和其加工制品中[2]。美洲、歐洲、非洲和亞洲溫帶地區(qū)的污染玉米中都發(fā)現(xiàn)了FB存在[3]。2011年，Biomin公司對(duì)來(lái)自世界各地的4 327份飼料及飼料原料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FB的陽(yáng)性檢出率為51%[4]。FB在國(guó)際上沒(méi)有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)FDA規(guī)定的食品中最大限量為2.0 μg/g[5]，歐盟為1.0 μg/g[6]，而我國(guó)至今未出臺(tái)FB的限量標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)暫定人類對(duì)FB每日最大耐受攝入量為2 μg/(kg·d)[7]。

伏馬毒素的毒性對(duì)人畜危害非常大。FB會(huì)對(duì)馬、豬、牛、羊、雞和鴨等牲畜的心臟、腎臟和肝臟產(chǎn)生致命毒性[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示人類食管癌與食用FB污染的谷物有關(guān)[9]。中國(guó)山東省某地區(qū)原發(fā)性肝癌發(fā)病率的提高也與FB污染有關(guān)[10]。國(guó)際癌癥研究中心評(píng)估伏馬毒素對(duì)人類的危害后，將其列為可能致癌物[11]。

去除糧油食品中的FB，保證食品安全是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Generotti等[12]研究了在工業(yè)加工過(guò)程FB在谷物制品中的含量變化，結(jié)果顯示清洗和谷物去皮可減少谷物粉中約40%的FB。Xing等[13]用ELISA法檢測(cè)八種植物的精油對(duì)FB1的降解作用，發(fā)現(xiàn)肉桂油對(duì)FB1的降解率達(dá)94.08%。Heinl等[14]在細(xì)菌Sphingopyxissp. MTA144中找到了水解FB1的關(guān)鍵基因，并且推測(cè)經(jīng)過(guò)兩步酶促反應(yīng)將FB1脫毒。FB的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定[15]，物理和化學(xué)方法不能有效去除FB，而且還會(huì)殘留其它物質(zhì)；生物法可將FB轉(zhuǎn)化、代謝為低毒或無(wú)毒產(chǎn)物，是一種非常有前景的方法。2014年11月，百奧明研發(fā)的FB降解酶制劑FUMzyme成為首個(gè)得到歐盟認(rèn)證的能將FB通過(guò)生物轉(zhuǎn)化降解為無(wú)毒代謝產(chǎn)物的酶制劑。有學(xué)者已經(jīng)篩選到了FB降解菌，Camilo等[16]從玉米和青貯飼料中篩選到1株酵母菌(SE3071)和3株芽孢桿菌(S9、S10和S69)，它們對(duì)FB1的降解率分別為57%、43%、48%和83%。Raffaella等[15]從意大利的玉米地采集了21份土壤樣品中分離到1株革蘭氏陰性菌NCB1492(疑似新種)，將該菌在BYE液體培養(yǎng)基(FB1含量為0.5 mg/mL)中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)5次轉(zhuǎn)接共培養(yǎng)了42 d，用薄層色譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FB1完全降解。本研究采用富集培養(yǎng)法，以FB1為唯一碳源，從污泥中分離到1株可以完全降解FB1的菌株，為食品和飼料中的FB降解研究提供良好的基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集于北京、河南和云南三地的土壤、污泥和發(fā)霉的玉米，詳細(xì)來(lái)源見表1。

表1 樣品來(lái)源

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

色譜級(jí)甲醇、乙腈：美國(guó)Thermo Fisher公司；FB1標(biāo)準(zhǔn)品：北京泰樂(lè)祺科技有限公司；PMD 19-T Vector、DNA Marker、Premix Taq酶：Takara公司；培養(yǎng)基及其它生化試劑：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)：MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.066 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，加去離子水定容至1 L，調(diào)pH至6.8；LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 L；PBS緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，加去離子水定容至1 L，用鹽酸調(diào)pH至7.4，培養(yǎng)基及緩沖液均于121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加1.3%的瓊脂粉；鄰苯二甲醛(OPA)衍生液：40 mg OPA溶于1 mL甲醇中，用5 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液稀釋，加50 μL β-巰基乙醇，混勻，避光保存；FB1毒素管：25 μg的FB1中加500 μL MSM液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀、熒光檢測(cè)器(2475)、Waters xbridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國(guó)Waters公司；Agilent 6510 Q-TOF LC/MS：美國(guó)Agilent公司；BIO-C1000型PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；二級(jí)生物安全柜：美國(guó)Esco公司；恒溫?fù)u床：瑞士Infors公司；紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 FB1降解菌株的篩選與分離

取5 g樣品于30 mL無(wú)菌水中混勻，靜置取上清液100 μL進(jìn)行梯度稀釋，分別取濃度為10-6、10-7和10-8的菌懸液200 μL于FB1毒素管中，在漩渦振蕩器上混勻，再涂布于固體MSM平板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。對(duì)長(zhǎng)出的菌斑劃線分離，于30 ℃培養(yǎng)3 ～ 5 d。挑取單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)10 d。從毒素管中取100 μL待測(cè)液于液相小瓶中，再加入400 μL 50%乙腈水和500 μL OPA衍生液，混勻，靜置1 min，HPLC檢測(cè)。

1.3.2 FB1的HPLC檢測(cè)方法

FB1的高效液相色譜檢測(cè)前處理及檢測(cè)條件參考GB/T 25228—2010[17]。

1.3.3 ASAG22的鑒定

形態(tài)鑒定：將純化的菌株在固體LB平板劃線，30 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣、表面、隆起形狀和透明度等指標(biāo)。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并拍照。

理化鑒定：在中國(guó)科學(xué)院微生物所用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)ASAG22進(jìn)行了68種碳源的利用試驗(yàn)和23種化學(xué)物質(zhì)的敏感試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：以ASAG22的菌液為模板，細(xì)菌的通用引物16SF和16SR作為上下游引物。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL， Premix Taq 12.5 μL，16SF、16SR各1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接體系10 μL：目的片段3 μL，PMD19-T Vector 1 μL，10×T4 DNA 連接緩沖液1 μL，T4 DNA 連接酶(350 U/μL)1 μL，ddH2O 4 μL，16 ℃連接8 h。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。對(duì)長(zhǎng)出的白菌斑進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，正確后送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上使用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.4 菌株生長(zhǎng)和降解能力的測(cè)定

菌株生長(zhǎng)曲線繪制：設(shè)置3組平行試驗(yàn)，分別從平板上挑取ASAG22單菌落于100 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)。每隔4 h取樣1次，并測(cè)其在波長(zhǎng)600 nm時(shí)的吸光度。

菌株降解曲線的繪制：設(shè)置3組平行試驗(yàn)，分別從平板上挑取ASAG22單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)。每隔1 d取樣1次，并用HPLC檢測(cè)，計(jì)算降解率。

1.3.5 降解FB1活性物質(zhì)的定位和性質(zhì)的初步分析

從平板上挑取ASAG22單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，按1%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d。取培養(yǎng)的菌液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min。上清液用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾，取500 μL上清濾液于FB1毒素管中，以100 ℃滅活的濾液作對(duì)照。將收集的菌體用30 mL PBS緩沖液清洗3次，并將菌體懸浮于30 mL PBS緩沖液中。用高壓細(xì)胞破碎儀，設(shè)置壓強(qiáng)為15 Kpsi，破碎菌體。菌體破碎液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾，取500 μL上清濾液于FB1毒素管中，以100 ℃滅活的上清濾液作對(duì)照。將500 μL PBS緩沖液加入FB1毒素管作為空白對(duì)照。試驗(yàn)組和對(duì)照組均于30 ℃，220 r/min培養(yǎng)3 d，用HPLC檢測(cè)。

取細(xì)胞破碎后的上清液2 mL加50 μL蛋白酶K(20 mg/mL)混勻，55 ℃溫浴1 h。分別取500 μL破碎上清液、蛋白酶K處理液和蛋白酶K處理滅活液加入FB1毒素管。30 ℃，220 r/min培養(yǎng)3 d，用HPLC檢測(cè)。

1.3.6 菌株ASAG22對(duì)FB1降解產(chǎn)物的初步分析

從平板上挑取ASAG22單菌落于FB1毒素管中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)。間隔1 d取樣，每次取樣100 μL，共取樣5次，5 ppm的FB1標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。每次取樣完畢，立即放入真空濃縮儀，60 ℃蒸干1 h。蒸干樣品于200 μL甲醇中超聲復(fù)溶，16 000 g離心10 min，取上清液稀釋10倍待測(cè)。質(zhì)譜條件參考李正翔等[18]的檢測(cè)方法。通過(guò)每個(gè)樣品特征離子提取及比對(duì)，分析ASAG22降解FB1后的產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 FB1降解菌株的篩選和分離

將采集的 14個(gè)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，對(duì)有降解能力的菌株進(jìn)行分離，從樣品E中分離出1株FB1高效降解菌，命名為ASAG22。在MSM培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min，培養(yǎng)5 d，可將25 μg的FB1完全降解，完全降解后的HPLC圖譜，如圖2所示。FB1保留時(shí)間RT=8.198 min，對(duì)照組樣品此處有強(qiáng)吸收峰，而加入降解菌的試驗(yàn)組樣品基本無(wú)FB1目標(biāo)峰檢出，表明培養(yǎng)液中FB1已被完全降解。

圖2 FB1完全降解后的HPLC圖譜

2.2 ASAG22的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

通過(guò)平板劃線培養(yǎng)5 d后觀察可發(fā)現(xiàn)：菌落呈黃色不透明，圓形，邊緣完整，表面光滑，有隆起，易挑取(圖3左)；革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，短桿狀(圖3右)。

圖3 菌株ASAG22的菌落特征和革蘭氏染色顯微鏡照片

2.2.2 理化鑒定

ASAG22可以利用D-甘露糖、龍膽二糖、L-乳酸和D-半乳糖等32種碳源，不能利用明膠、檸檬酸、D-山梨醇和甘油等36種碳源。對(duì)四唑藍(lán)、萘啶酸和1%NaCl等10種化學(xué)物質(zhì)敏感，對(duì)氯化鋰、溴酸鈉和四唑紫等13種化學(xué)物質(zhì)不敏感。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

將經(jīng)過(guò)酶切和PCR驗(yàn)證得到的16S rDNA基因片段進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其大小為1 494 bp。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：菌株ASAG22與鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)同源性高達(dá)99%。送中科院微生物所進(jìn)行菌種鑒定，根據(jù)菌株的細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA序列等試驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析，鑒定該菌為鞘氨醇盒菌。

2.3 菌株的生長(zhǎng)特性和降解特性

降解菌ASAG22的生長(zhǎng)曲線與降解曲線如圖4所示。在液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在MSM培養(yǎng)基中，降解菌的生長(zhǎng)雖緩慢，但對(duì)FB1有很好的降解效果。從2 d開始降解速率明顯加快，培養(yǎng)5 d可將培養(yǎng)基中的毒素(25 μg)完全清除。

圖4 降解菌ASAG22的生長(zhǎng)曲線與降解曲線

2.4 降解FB1活性物質(zhì)的定位和性質(zhì)的初步分析

菌株ASAG22的培養(yǎng)液上清和菌體破碎后的上清對(duì)FB1的降解率分別為13%和99%，而兩者的滅活液沒(méi)有降解效果(圖5)。這表明，菌株ASAG22的某種胞內(nèi)活性物質(zhì)能夠降解FB1。進(jìn)一步研究表明，加入蛋白酶K的上清液和兩者滅活液對(duì)FB1的降解能力明顯降低(圖6)，這說(shuō)明，菌株ASAG22胞內(nèi)產(chǎn)生的這種活性物質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后失去了活性。初步推斷，ASAG22對(duì)FB1的降解源于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性物質(zhì)，且該物質(zhì)被蛋白酶K處理后失去對(duì)FB1的降解能力。

圖5 不同上清液對(duì)FB1的降解率 注：CK1為菌液上清滅活 上清1為菌液上清；CK2為破碎上清滅活 上清2為破碎上清。

圖6 不同處理方法對(duì)FB1的降解率 注：處理1為上清加蛋白酶K；處理2為上清；處理3為上清和蛋白酶K都滅活。

2.5 菌株ASAG22對(duì)FB1降解產(chǎn)物的初步分析

分析每個(gè)樣品的總離子流圖(圖7，從上到下依次為對(duì)照組和1～5 d的TIC圖譜)，與FB1標(biāo)準(zhǔn)品的TIC圖譜比對(duì)后發(fā)現(xiàn)4種豐度較高的新物質(zhì)：406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9(4種新物質(zhì)對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比標(biāo)注在第5天的TIC圖譜中)。其中406.352 7可以初步認(rèn)定為FB1脫去2分子丙三羧酸后的產(chǎn)物，這一結(jié)果與Heinl等[14]的研究結(jié)果一致，其他的新物質(zhì)有待進(jìn)一步確證。

圖7 ASAG22對(duì)FB11～5 d降解產(chǎn)物的TIC圖譜

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)富集培養(yǎng)法，從污泥樣品中篩選到1株鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)，命名為ASAG22。在MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，可將25 μg的FB1完全降解。

3.2 該菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性物質(zhì)可以將FB1降解，且該活性物質(zhì)經(jīng)蛋白酶K處理而失去活性。

3.3 分析時(shí)間梯度降解試驗(yàn)的TIC圖譜，發(fā)現(xiàn)FB1降解產(chǎn)物中有4種高豐度產(chǎn)物，分別是406.352 7、288.209 9、264.182 7和220.156 9。

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Screening and Identification of A Fumonisins Degradation Bacteria

Yang Pengfei1,2Chang Xiaojiao2,3Wu Songling2Wang Jun2Wang Nanxi2Qu Lingbo1Sun Changpo2
(College of Bioengineering, Henan University of Technology1, Zhengzhou 450001)(Academy of State Administration of Grain2, Beijing 100037)(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology3, Zhengzhou 450001)

Using fumonisins FB1as the sole carbon source, a bacterial strain efficiently degrading the FB1degradation strain was screened from sludge samples by an enrichment culture approach. The strain, finally named ASAG22, can degrade FB1well in liquid MSM culture and completely degrade 25 μg FB1in 5 days by high performance liquid chromatography detection. It was identified asSphingopyxissp. on the basis of homology analysis of the 16S rDNA sequence analysis combining with physiological and biochemical test. Further research about the degradation mechanism of strain showed that the active substance generated from ASAG22 cell degraded FB1into four new degradation products, i.e., 406.352 7, 288.209 9, 264.182 7 and 220.156 9.And the active material can inactivate through the treatment of proteinase K.

fumonisins,Sphingopyxissp., biodegradation

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB127805)

2015-09-08

楊朋飛，男，1989年出生，碩士，藥物化學(xué)

孫長(zhǎng)坡，男，1975年出生，博士，研究員，糧油微生物與質(zhì)量安全

Q939.9

A

1003-0174(2017)04-0110-06