彭 松 張 敏 李小勤 趙金鑫 鄭小淼 李百安 魏 靜 冷向軍,(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 006)(豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海 007)(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心(ZF06)，上海 006)

發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦的作用效果研究

彭 松1張 敏2李小勤1趙金鑫1鄭小淼1李百安1魏 靜1冷向軍1,3
(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院1，上海 201306)(豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司2，上海 200137)(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心(ZF1206)3，上海 201306)

本試驗(yàn)旨在研究發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用、肝胰腺消化酶活性和血淋巴非特異性免疫指標(biāo)的影響。以豆粕(負(fù)對(duì)照組)、發(fā)酵豆粕T468、P839、B356和Y918等蛋白質(zhì)替代正對(duì)照飼料中6%魚粉(正對(duì)照飼料含21%魚粉)，另以發(fā)酵豆粕B356等蛋白質(zhì)替代正對(duì)照飼料中9%魚粉(B356-2)，配制成7組等氮飼料，飼喂平均質(zhì)量4.0 g的凡納濱對(duì)蝦42 d。結(jié)果表明：發(fā)酵可部分降解豆粕中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白質(zhì)及大分子蛋白質(zhì)，提高粗蛋白質(zhì)和小肽含量；與負(fù)對(duì)照組相比，發(fā)酵豆粕T468、P839、B356、Y918替代6%魚粉后，提高凡納濱對(duì)蝦增重率16.7%、12.0%、9.9%、11.9%，降低飼料系數(shù)18.1%、13.7%、12.6%、14.8%(P<0.05)，到達(dá)和正對(duì)照組基本一致的生長(zhǎng)性能，同時(shí)顯著提高了蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率、干物質(zhì)消化率和蛋白質(zhì)消化率(P<0.05)；各發(fā)酵豆粕組均較負(fù)對(duì)照組顯著提高了肝胰腺淀粉酶活性和血淋巴SOD活性(P<0.05)，P839組的蛋白酶活性和血淋巴PO活性顯著高于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)。發(fā)酵可改善豆粕的可利用性，在不影響凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用的前提下，發(fā)酵豆粕可替代飼料中6%魚粉。

凡納濱對(duì)蝦 發(fā)酵豆粕 生長(zhǎng) 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率 消化酶活性 非特異性免疫

魚粉是水產(chǎn)飼料常用的動(dòng)物蛋白原料，但資源有限，價(jià)格居高不下，開發(fā)植物蛋白源以全部或部分代替魚粉一直是行業(yè)界關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。與其他植物蛋白源相比，豆粕的蛋白質(zhì)含量高、富含賴氨酸，資源豐富，已在水產(chǎn)飼料中得到了較廣泛的應(yīng)用。然而，與魚粉相比，豆粕的蛋氨酸含量低，含多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子，可降低胰蛋白酶活性[1]，誘導(dǎo)胰蛋白酶補(bǔ)償性分泌造成含硫氨基酸的內(nèi)源性損失[2]；豆粕含約30%抗原蛋白質(zhì)，主要是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白[3]，可引起斷奶仔豬生長(zhǎng)性能降低及腸道過(guò)敏反應(yīng)[4]。此外，豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為24.44%[5]，對(duì)于消化系統(tǒng)發(fā)育不完全的幼齡水產(chǎn)動(dòng)物以及消化道較短的蝦蟹而言，大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入消化道后，未充分消化吸收便排出體外，既浪費(fèi)原料，又增加了N、P排放[6]。

發(fā)酵是指在可控條件下利用微生物降解動(dòng)、植物原料并產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的過(guò)程，是改善飼料原料可利用性的一種有效方式。研究表明，發(fā)酵可消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，把大分子蛋白質(zhì)降解為易消化吸收的可溶性蛋白質(zhì)、多肽和寡肽，把纖維類物質(zhì)分解為糖，部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸，產(chǎn)生大量有益微生物，同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶、非淀粉多糖酶、脂肪酶等活性物質(zhì)[7-10]。目前，常用的發(fā)酵菌種有芽孢桿菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌等。

研究表明，在不影響生長(zhǎng)性能的前提下，發(fā)酵豆粕可替代石斑魚(Epinepheluscoioides)飼料中10%魚粉[11]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)幼魚飼料中30%魚粉[12]、金鯧(Trachinotusovatus)飼料中8%魚粉[13]、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)幼魚飼料中23%魚粉[14]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei(Boone))飼料中34%魚粉[15]。發(fā)酵豆粕在不同水產(chǎn)飼料中替代魚粉比例的不同，與發(fā)酵豆粕質(zhì)量、水產(chǎn)動(dòng)物種類、基礎(chǔ)飼料組成，特別是魚粉含量等因素有關(guān)，而發(fā)酵豆粕質(zhì)量又與發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝等有關(guān)。

目前，鮮見(jiàn)來(lái)自于不同發(fā)酵菌種的發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦作用效果的比較，因此，本試驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，比較了3種不同菌種發(fā)酵的豆粕等蛋白質(zhì)替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、體組成、肝胰腺消化酶活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和血淋巴非特異性免疫的影響，為發(fā)酵豆粕在對(duì)蝦飼料中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵豆粕制備及聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

所用豆粕及發(fā)酵豆粕均由豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司提供，豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、枯草芽孢桿菌+酵母菌(Saccharomyces)和枯草芽孢桿菌+乳酸菌(Lactobacillus)發(fā)酵分別獲得3種發(fā)酵豆粕B356、T468和P839；另外，從市場(chǎng)購(gòu)得某商品發(fā)酵豆粕Y918。參照Marsman等[16]的方法，對(duì)豆粕及發(fā)酵豆粕進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析；揮發(fā)性鹽基氮(VBN)的測(cè)定參照GB/T 5009.44—1996[17]；小肽的測(cè)定采用三氯乙酸沉淀法；胰蛋白酶抑制因子(TI)的測(cè)定參照NY/T 1103.2—2006[18]。豆粕及發(fā)酵豆粕主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 豆粕及發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)組成(風(fēng)干基礎(chǔ))

注：“—”表示數(shù)據(jù)未測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料配方

配制含21%魚粉的正對(duì)照飼料，在此基礎(chǔ)上，將魚粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為15%，以10%豆粕(負(fù)對(duì)照)、7%發(fā)酵豆粕T468、7.5%發(fā)酵豆粕P839、8%發(fā)酵豆粕B356和8%發(fā)酵豆粕Y918等蛋白替代飼料中6%魚粉，另外，以12%發(fā)酵豆粕B356替代9%魚粉組(B356-2)，共制成7種等氮飼料(表2)。根據(jù)凡納濱對(duì)蝦對(duì)氨基酸的需求量[19]，分別向各魚粉替代組添加微囊蛋氨酸、微囊賴氨酸、微囊蘇氨酸(廣東海納川藥業(yè)股份有限公司，有效質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、39%、50%)，使其達(dá)到與正對(duì)照飼料一致的水平；同時(shí)，添加0.02%氧化釔作為指示劑，以測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。主要飼料原料粉碎過(guò)60目篩，逐級(jí)混勻，以絞肉機(jī)制成粒徑1.2 mm飼料，95 ℃后熟化25 min，45 ℃烘干6 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 試驗(yàn)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))/%

注：1)配方中飼料原料購(gòu)于上海農(nóng)好飼料有限公司。其中魚粉(秘魯)、豆粕、花生粕、肉骨粉、魷魚膏、啤酒酵母和次粉的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分別為67.79%、47.82%、48.89%、51.81%、32.57%、49.95%和17.40%。

2)每千克維生素預(yù)混料含有：VA 12 500 000 IU，VD33 000 000 IU，VE 100 000 IU，VK36 870 mg，VB120 000 mg，VB230 000 mg，VB630 000 mg，VB1240 mg，D-生物素800 mg，煙酰胺60 000 mg，D-泛酸鈣50 000 mg。

3)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有：Ca(IO3)210 g，CoCl2·6H2O 10 g，CuSO4·5H2O 8 g，F(xiàn)eSO4·H2O 16.7 g，ZnSO4·H2O 22.9 g，MnSO4·H2O 6.3 g，Na2SeO3·5H2O 2 g，MgSO4·7H2O 66.7 g，KCl 500 g，NaCl 200 g，Ca(H2PO4)2157.5 g。

4)其他包含：豆粕15%、花生粕15%、肉骨粉5%、魷魚膏5%、啤酒酵母5%、大豆磷脂1.5%、魚油2%、磷酸二氫鈣2%、60%氯化膽堿0.5%、35%VC 0.1%和肌醇0.04%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于上海市浦東新區(qū)濱海鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)，取規(guī)格一致、體格健壯的凡納濱對(duì)蝦(平均體質(zhì)量為4.0 g)1 680尾，隨機(jī)分配于28口網(wǎng)箱(2.0 m×1.0 m×1.2 m)，每網(wǎng)箱60尾，試驗(yàn)共7個(gè)處理組，每處理4重復(fù)。試驗(yàn)前馴養(yǎng)1周，待對(duì)蝦適應(yīng)環(huán)境且正常攝食后開始試驗(yàn)。養(yǎng)殖期間，每日投喂4次(07:00、12:00、17:00、22:00)，投飼率為蝦體重4%～7%，以投飼后2.5 h內(nèi)食完為宜，并根據(jù)天氣及攝食情況作適當(dāng)調(diào)整，使各網(wǎng)箱投飼量基本一致；晝夜充氣，每周換水1/5。試驗(yàn)期間，水溫28.2～30.4 ℃，鹽度0.5‰～1.0‰，溶氧>5.6 mg/L，pH 7.8～8.5，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.1 mg/L。飼養(yǎng)試驗(yàn)共持續(xù)42 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)于上海海洋大學(xué)濱?；厥覂?nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。

1.4 樣品采集及分析

1.4.1 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)開始前，取40尾對(duì)蝦于-20 ℃冰箱保存，其中5尾蝦合并為1個(gè)樣本，用于初始樣品體成分分析。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，蝦體饑餓12 h，逐網(wǎng)箱計(jì)數(shù)稱重。從每網(wǎng)箱取15尾對(duì)蝦，其中3尾存放于-20 ℃冰箱中，用于全蝦體組成分析；12尾于頭胸甲后插入圍心腔取血淋巴，4尾蝦的血淋巴合并為一個(gè)樣本，4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存，用于免疫指標(biāo)分析；將采血后的對(duì)蝦解剖，取肝胰腺于-20 ℃保存，用于消化酶分析。

其余對(duì)蝦在稱重后放回原網(wǎng)箱暫養(yǎng)，投喂原飼料，待穩(wěn)定后參照Lin等[20]方法收集糞便。用虹吸管將糞便吸至篩網(wǎng)，收集完整糞便于-20 ℃保存，用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率分析。

1.4.2 飼料、糞便、全蝦組成和釔元素分析

飼料和全蝦組成測(cè)定包括水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分、釔(僅飼料)，糞便測(cè)定包括粗蛋白質(zhì)和釔含量。水分采用105 ℃烘干法(GB 6434—1986)，粗蛋白質(zhì)采用KjeltecTM2300凱氏定氮儀(丹麥FOSS公司)測(cè)定(GB/T 6432—1994)，灰分采用550 ℃灼燒法(GB/T 6432—1992)，飼料粗脂肪采用SOX416索氏脂肪測(cè)定儀(德國(guó)Gerhardt公司)測(cè)定；全蝦粗脂肪采用氯仿-甲醇法測(cè)定；釔元素用等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP)測(cè)定。

1.4.3 血淋巴免疫指標(biāo)

總超氧化物歧化酶(T-SOD)和堿性磷酸酶(AKP)采用南京建成試劑盒測(cè)定。T-SOD單位定義(U/mL)：每mL反應(yīng)液中T-SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的T-SOD量為一個(gè)活力單位。AKP單位定義(U/100 mL)：100 mL血淋巴在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚定義為一個(gè)金氏單位。

酚氧化酶(PO)測(cè)定以L-dopa為底物，參照王雷等[21]方法適當(dāng)修改后進(jìn)行。將3 mL 0.1 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液與0.1 mL 0.01 mol/L的L-dopa及0.1 mL待測(cè)血淋巴于室溫下混勻，每隔2 min讀取490 nm波長(zhǎng)下吸光值。PO單位定義(U/mL)：以A490對(duì)反應(yīng)時(shí)間(min)作圖，以試驗(yàn)條件下A490每1 min增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

1.4.4 肝胰腺消化酶

蛋白酶測(cè)定采用福林酚法[22]。蛋白酶單位定義(U/mg prot)：1 mg組織蛋白質(zhì)在40 ℃、pH 9.8條件下1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個(gè)酶活力單位。脂肪酶和淀粉酶采用南京建成試劑盒測(cè)定。脂肪酶單位定義(U/mg prot)：37 ℃條件下，1 mg組織蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物定義為一個(gè)酶活力單位。淀粉酶單位定義(U/mg prot)：1 mg組織蛋白質(zhì)在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個(gè)酶活力單位。

1.4.5 計(jì)算公式

增重率=(末體重-初體重)/初體重×100%；

成活率=末尾數(shù)/初尾數(shù)×100%；

飼料系數(shù)=攝食量/(末體重-初體重)；

蛋白質(zhì)效率=(末體重-初體重)/(投飼量×飼料蛋白質(zhì)含量)；

蛋白質(zhì)沉積率=(末體重×末全蝦蛋白質(zhì)含量-初體重×初全蝦蛋白質(zhì)含量)/(投飼量×飼料蛋白質(zhì)含量)×100%；

脂肪沉積率=(末體重×末全蝦脂肪含量-初體重×初全蝦脂肪含量)/(投飼量×飼料脂肪含量)×100%；

干物質(zhì)消化率=(糞便釔含量-飼料釔含量)/糞便釔含量×100%；

蛋白質(zhì)表觀消化率=(糞便釔含量×飼料蛋白質(zhì)含量-飼料釔含量×糞便蛋白質(zhì)含量)/(糞便釔含量×飼料蛋白質(zhì)含量)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 豆粕發(fā)酵前后蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

由圖1可見(jiàn)，豆粕的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布較廣，在70、50、35、20 ku附近較為集中，含有大量抗原蛋白，如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。經(jīng)微生物發(fā)酵后，在B356和P839發(fā)酵豆粕中，分子質(zhì)量大于25 ku的蛋白質(zhì)大部分被降解，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白明顯減少，小分子蛋白質(zhì)明顯增加。在發(fā)酵豆粕T468中，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量也有一定程度降低，但大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)含量相對(duì)較多，大部分蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量小于55 ku。

圖1 發(fā)酵豆粕SDS-PAGE

2.2 生長(zhǎng)性能

由表3可見(jiàn)，正對(duì)照組具有最高增重率和最低飼料系數(shù)，而負(fù)對(duì)照組的增重率最低，飼料系數(shù)最高；與負(fù)對(duì)照(豆粕組)相比，除B356-2外，各發(fā)酵豆粕組的增重率均顯著提高(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著降低(P<0.05)，并達(dá)到了與正對(duì)照組基本一致的水平；在發(fā)酵豆粕B356組，隨替代魚粉比例由6%(B356-1)增加到9%(B356-2)，增重率呈下降趨勢(shì)。各處理組在成活率上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

此外，在養(yǎng)殖期間，正對(duì)照組、B356和Y918組對(duì)蝦通常在投喂后1.5～2 h內(nèi)攝食完畢，而T468、P839組和負(fù)對(duì)照組通常在投喂后2～2.5 h內(nèi)攝食完畢。

表3 發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

注：同列數(shù)據(jù)后具不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，余同。

2.3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率

由表4可見(jiàn)，負(fù)對(duì)照組蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率、干物質(zhì)及蛋白質(zhì)消化率最低；與負(fù)對(duì)照相比，除B356-2外，各發(fā)酵豆粕組蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率、干物質(zhì)及蛋白質(zhì)消化率均顯著增高(P<0.05)，并達(dá)到了與正對(duì)照基本一致的水平；在發(fā)酵豆粕B356組，當(dāng)替代魚粉比例由6%(B356-1)增加到9%(B356-2)時(shí)，干物質(zhì)及蛋白質(zhì)消化率未受影響(P>0.05)，但蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率顯著下降(P<0.05)。各處理組在脂肪沉積率上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 發(fā)酵豆粕對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的影響

2.4 全蝦成分

由表5可見(jiàn)，各處理組在全蝦水分、灰分含量上無(wú)顯著差異(P>0.05)；正對(duì)照組具有最高粗蛋白含量和最低粗脂肪含量，B356-1、B356-2分別具有最高粗脂肪含量和最低粗蛋白含量。

表5 發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦全蝦組成的影響/%

2.5 肝胰腺消化酶活性

由表6可見(jiàn)，正對(duì)照組具有最高的蛋白酶和淀粉酶活性，而負(fù)對(duì)照組的蛋白酶和淀粉酶活性最低；與負(fù)對(duì)照相比，各發(fā)酵豆粕組的淀粉酶活性均顯著升高(P<0.05)，但在蛋白酶活性上，僅P839組顯著升高(P<0.05)，其他組僅在數(shù)值上有所增加；各處理組在脂肪酶活性上沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表6 發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化酶活性的影響/U/mg prot

2.6 血淋巴非特異性免疫指標(biāo)

由表7可見(jiàn)，負(fù)對(duì)照組的T-SOD活性和PO活性均為最低，與負(fù)對(duì)照組相比，各發(fā)酵豆粕組的T-SOD活性均顯著升高(P<0.05)，PO活性在不同程度上也有增加，其中P839組的T-SOD、PO活性最高；在AKP活性方面，正對(duì)照組的AKP活性最低，而P839組具有最高AKP活性。

表7 發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦血淋巴非特異性免疫的影響/U/100 mL

3 討論

3.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

在相同配方條件下，石斑魚[12]、凡納濱對(duì)蝦[16]及雜交鱸(Moronechrysops×Moronesaxatilis)[23]攝食發(fā)酵豆粕組飼料，較攝食豆粕組飼料具有更高增重率和更低飼料系數(shù)；Barnes等[12]研究表明，發(fā)酵豆粕可替代虹鱒幼魚飼料中30%魚粉，Zhou等[24]認(rèn)為發(fā)酵豆粕可替代黑鯛幼魚飼料中12%魚粉，然而替代更高比例的魚粉，會(huì)降低虹鱒、黑鯛生長(zhǎng)性能及飼料利用效率。本試驗(yàn)中，與負(fù)對(duì)照相比，發(fā)酵豆粕T468、P839、B356、Y918替代6%魚粉，均顯著提高了凡納濱對(duì)蝦增重率，降低了飼料系數(shù)，并達(dá)到與正對(duì)照組基本一致的水平；在發(fā)酵豆粕B356組，隨替代魚粉比例由6%(B356-1)增加到9%(B356-2)，增重率呈下降趨勢(shì)，飼料系數(shù)呈增高趨勢(shì)，與其他研究結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)中，各魚粉替代飼料中均補(bǔ)充了微囊蛋氨酸、賴氨酸和蘇氨酸，使其達(dá)到了與對(duì)照組一致的水平，消除了由于這些必需氨基酸缺乏對(duì)蝦體生長(zhǎng)的影響；此外，各試驗(yàn)組的投飼量也保持在基本一致的水平，排除了采食量不同對(duì)生長(zhǎng)性能的影響。因此，本試驗(yàn)中發(fā)酵豆粕組蝦體生長(zhǎng)性能的提高主要與微生物發(fā)酵對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的提高有關(guān)，也可能與發(fā)酵產(chǎn)生的一些未知因子有關(guān)。

3.2 發(fā)酵對(duì)抗養(yǎng)因子的消除和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的提高

Refstie等[7]以乳酸菌發(fā)酵豆粕，其胰蛋白酶抑制因子(TI)含量由6.19 μg/g降為0.90 μg/g，蔗糖(含量由59.3 g/kg降為0.9 g/kg；豆粕經(jīng)米曲霉發(fā)酵后，TI含量由2.70 mg/g降為0.42mg/g[8]；以假絲酵母發(fā)酵豆粕，TI、植物凝集素、脲酶分別由10.05、30.75、3.25 mg/g降為1、0.05、0.02 mg/g[24]；以枯草芽孢桿菌、米曲霉發(fā)酵豆粕，TI由3.508 mg/g降為0.164、0.655 mg/g[3]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵豆粕T468、P839和B356中TI含量由6.00 mg/g降為1.26、0.63、0.96 mg/g，SDS-PAGE分析也顯示大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白明顯減少，說(shuō)明微生物發(fā)酵顯著降低了豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

消化酶活性是評(píng)價(jià)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化能力的重要指標(biāo)。Feng等[25]以枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，顯著提高了斷奶仔豬十二指腸胰蛋白酶活性。本試驗(yàn)中，豆粕經(jīng)發(fā)酵后，TI、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量明顯減少，各發(fā)酵豆粕組對(duì)蝦肝胰腺淀粉酶活性顯著提高，蛋白酶活性也在不同程度有所提高。這說(shuō)明，凡納濱對(duì)蝦消化酶活性的提高與發(fā)酵降解了胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白有關(guān)，也可能與發(fā)酵產(chǎn)物刺激了消化酶的分泌有關(guān)，這有待今后進(jìn)一步研究。

Teng等[3]發(fā)現(xiàn)，豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌和米曲霉發(fā)酵后，其蛋白質(zhì)體外消化率顯著增高。在Kiers等[26]研究中，以芽孢桿菌發(fā)酵大豆48 h后，大豆的體外消化率由29%增加到33%～43%。發(fā)酵可將大分子蛋白降解為易于消化吸收的可溶性蛋白、多肽和寡肽，纖維類物質(zhì)分解為糖，部分糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[7-10]。本試驗(yàn)的SDS-PAGE分析表明，發(fā)酵豆粕P839和B356蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大部分小于25 ku，T468的蛋白質(zhì)分子量也有降低，三者的小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.00%(未發(fā)酵豆粕)增加到6.64%、6.41%和10.11%；消化試驗(yàn)則表明各發(fā)酵豆粕組的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)表觀消化率均較未發(fā)酵組顯著提高，這說(shuō)明發(fā)酵降解了大分子蛋白質(zhì)，提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，從而提高蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率和凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能。

3.3 發(fā)酵豆粕對(duì)血淋巴非特異性免疫的影響

Kim等[27]在飼料中添加4%米曲霉發(fā)酵豆粕及0.08%米曲霉均顯著提高了鸚鵡魚(Oplegnathusfasciatus)肝臟SOD活性，并認(rèn)為這種抗氧化性的增高與游離型大豆異黃酮，特別是苷元和丙二酰基葡萄糖苷異黃酮含量的增高有關(guān)。在飼料中添加10～20 mg/kg大豆異黃酮可顯著提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)血清SOD活性[28]。大豆異黃酮活性的高低與母核上糖基側(cè)鏈有關(guān)，去掉糖基側(cè)鏈的游離型大豆異黃酮的活性可顯著增高。發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可使異黃酮葡萄糖苷水解成游離型大豆異黃酮，提高其生物活性。本試驗(yàn)中，各發(fā)酵豆粕組的血淋巴T-SOD活性均較未發(fā)酵組顯著提高，PO活性也在不同程度上有所增高，這可能與發(fā)酵增高了游離型大豆異黃酮含量有關(guān)。此外，發(fā)酵豆粕中還含有大量有益微生物，這些微生物進(jìn)入腸道后與病原菌競(jìng)爭(zhēng)宿主，并通過(guò)其代謝物調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，從而提高機(jī)體抗病能力[29-30]。在今后有關(guān)發(fā)酵豆粕的研究中，有必要對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)一步闡明發(fā)酵豆粕的作用機(jī)理。

4 結(jié)論

發(fā)酵可部分降解豆粕中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白質(zhì)及大分子蛋白質(zhì)，提高粗蛋白質(zhì)及小肽含量。本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵豆粕T468、P839、B356可替代飼料中6%的魚粉而不影響凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用，并可提高凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫功能。

[1]Francis G,Makkar H P S,Becker K.Antinutritional factors present in plant-derived alternate fish feed ingredients and their effects in fish[J].Aquaculture,2001,199(3):197-227[2]Schneeman B O,Gallaher D.Pancreatic response to dietary trypsin inhibitor:variation among species[M]. Friedman M.Nutritional and Toxicological Significance of Enzyme Inhibitors in Food.Springer US,1986:185-187

[3]Teng D,Gao M Y,Yang Y L,et al.Bio-modification of soybean meal withBacillussubtilisorAspergillusoryzae[J].Biocatalysis and Agriculture Biotechnology,2012,1(1):32-38

[4]Sun P,Li D F,Dong B,et al.Effects of soybean glycinin on performance and immune function in early weaned pigs[J].Archives of Animal Nutrition,2008,62(4):313-321

[5]馬文強(qiáng),馮杰,劉歡.微生物發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)特性研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2008,23(1):121-124 Ma W Q,Feng J,Liu H. Nutritional characteristics of microbe fermented soybean meal[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2008,23(1):121-124

[6]Bergheim A,Aabel J P,Seymour E A.Past and present approaches to aquaculture waste management in Norwegian net pen culture operations[C]//Nutritional Strategies and Aquaculture Waste:First International Symposium on Nutritional Strategies in Management of Aquaculture Waste.Guelph,1991:117-136

[7]Refstie S,Sahlstr?m S,Br?then E,et al.Lacticacidfermentation eliminates indigestible carbohydrates and antinutritional factors in soybean meal for Atlantic salmon(Salmosalar)[J].Aquaculture,2005,246(1):331-345

[8]Hong K J,Lee C H,Kim S W.AspergillusoryzaeGB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals[J].Journal of Medicinal Food,2004,7(4):430-435

[9]Abdullah S S S,Randeran Z,Noor M A M.Production of amylase enzyme through solid state fermentation byAspergillusniger[J].Journal of Chemistry and Chemical Engineering,2010,4(11):23-26

[10]李建.發(fā)酵豆粕研究進(jìn)展[J].糧食與飼料工業(yè),2009(6):31-35 Li J.The research progress of fermented soybean meal[J].Cereal & Feed industry,2009(6):31-35

[11]Luo Z,Liu Y J,Mai K S,et al.Partial replacement of fish meal by soybean protein in diets for grouperEpinepheluscoioidesjuveniles[J].Journal of Fisheries of China,2004,28(2):175-181

[12]Barnes M E,Brown M L,Rosentrater K A,et al.An initial investigation replacing fish meal with a commercial fermented soybean meal product in the diets of juvenile rainbow trout[J].Open Journal of Animal Sciences,2012,2(4):234-243

[13]Lin H Z,Chen X,Chen S S,et al.Replacement of fish meal with fermented soybean meal in practical diets for pompanoTrachinotusovatus[J].Aquaculture Research,2012,44(1):151-156

[14]Yuan Y C,Lin Y C,Yang H J,et al.Evaluation of fermented soybean meal in the practical diets for juvenile Chinese sucker,Myxocyprinusasiaticus[J].Aquaculture Nutrition,2013,19(1):74-83

[15]Shiu Y L,Wong S L,Guei W C,et al.Increase in the plant protein ratio in the diet of white shrimp,Litopenaeusvannamei(Boon),usingBacillussubtilisE20-fermented soybean meal as a replacement[J].Aquaculture Research,2015,46(2):382-394

[16]Marsman G J P,Gruppen H,Mul A J,et al.Invitroaccessibility of untreated,toasted,and extruded soybean meals for protease and carbohydrates[J].Journal of Agriculture Food Chemistry,1997,45(10):4088-4095

[17]GB/T 5009.44—1996.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S] GB/T 5009.44—1996.Method for analysis of hygienic standard of meat and meat products[S][18]NY/T 1103.2—2006.轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè) 抗?fàn)I養(yǎng)素 2部分：胰蛋白酶抑制劑的測(cè)定[S] NY/T 1103.2—2006.Transgenic plants and its products’ edible safety testing,Antinutrients,2:The determination of trypsin inhibitor[S]

[19]Akiyama D M,Dominy W G,Lawrence A L.Penaeidshrimp nutrition[M]. Lester L J,Pante M J R,Fast A W,et al.Marine shrimp culture:principles and practices.Elservier Science Publishers,1992,555-568

[20]Lin H Z,Guo Z X,Yang Y Y,et al.Effect of dietary probiotics on apparent digestibility coefficients of nutrients of white shrimpLitopenaeusvannameiBoone[J].Aquaculture Research,2004,35(15):1441-1447

[21]王雷,李光友,毛遠(yuǎn)興.中國(guó)對(duì)蝦血淋巴中的抗菌、溶菌活力與酚氧化酶活力的測(cè)定及其特性研究[J].海洋與湖沼,1995,26(2):179-185 Wang L,Li G Y,Mao Y X.Studies on the activities and characteristics of the antibacterial,bacteriolysis and phenoloxidase in the haemolymph of penaeus chinensis[J].Oceanologia et limnologiasinica,1995,26(2):179-185

[22]張龍翔,張庭芳,李令媛,等.生化試驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京:人民教育出版社,1981 Zhang L X,Zhang T F,Li L Y,et al.Biochemical experiment method and technology[M].Beijing:People’s Education Press,1981

[23]Rombenso A,Crouse C,Trushenski J.Comparison of traditional and fermented soybean meals as alternatives to fish meal in hybrid striped bass feeds[J].North American Journal of Aquaculture,2013,75(2):197-204

[24]Zhou F,Song W X,Shao Q J,et al.Partial replacement of fish meal by fermented soybean meal in diets for black sea breamAcanthopagrusschlegeliijuveniles[J].Journal of the World Aquaculture Society,2011,42(2):184-197

[25]Feng J,Liu X,Xu Z R,et al.Effect of fermented soybean meal on intestinal morphology and digestive enzyme activities in weaned piglets[J].Digestive Diseases and Sciences,2007,52(8):1845-1850

[26]Kiers J L,Van Laeken A E A,Rombouts F M,et al.Invitrodigestibility ofBacillusfermented soya bean[J].International Journal of Food Microbiology,2000,60(2):163-169

[27]Kim S S,Galaz G B,Pham M A,et al.Effects of dietary supplementation of a meju,fermented soybean meal,andAspergillusoryzaefor juvenile Parrot fish(Oplegnathusfasciatus)[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2009,22(6):849-856

[28]胡海濱,劉金桃,李彥先,等.飼料中大豆黃酮對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)、消化酶活力、抗氧化力及腸道結(jié)構(gòu)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2014,38(9):1503-1513 Hu H B,Liu J T,Li Y X,et al.Effects of dietary daidzein on growth performance,activities of digestive enzymes anti-oxidative ability and intestinal morphology in juvenile turbot(ScophthalmusmaximusL.)[J].Journal of Fisheries of China,2014,38(9):1503-1513

[29]王亞敏,王印庚.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(6):72-75 Wang Y M,Wang Y G.Advance in the mechanisms and application of microecologics in aquaculture[J].Progress in Veterinary Medicine,2008,29(6):72-75

[30]張新明.對(duì)蝦養(yǎng)殖用微生態(tài)制劑菌株的篩選與應(yīng)用效果的研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2004 Zhang X M.Selection and using effect of probiotics for shrimp culturing[D].Qingdao：Ocean University of China,2004.

Effect of Replacing Fish Meal with Fermented Soybean Meal on White Shrimp,Litopenaeusvannamei(Boone)

Peng Song1Zhang Min2Li Xiaoqin1Zhao Jinxin1Zheng Xiaomiao1Li Baian1Wei Jing1Leng Xiangjun1,3
(College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University1,Shanghai 201306)(Wilmar Biotechnology Research & Development Center(Shanghai)Co.,Ltd.2,Shanghai 200137)(Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources,Ministry of Aquaculture；Shanghai Engineering Technology Research Center of Aquaculture；Shanghai University Knowledge Service Platform,Aquatic Animal Genetic Breeding Center(ZF1206),Shanghai Ocean University3,Shanghai 201306)

The present study was aimed at studying the influence of replacing fish meal with fermented soybean meal(FSM)on the index about growth,nutrients utilization,activities of digestive enzymes in hepatopancreas and hemolymph non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei.Seven groups nitrogenous fodders were prepared by replacing 6% fish meal in positive control fodder group(containing 21% fish meal)with soybean meal(SM)(negative control group),fermented SM T468,P839,B356,and Y918 proteins respectively,and by replacing 9% fish meal(B356-2)

in positive control group with fermented SM B356.The seven groups nitrogenous fodders were fedLitopenaeusvannameiwhich with average weight of 4.0 g for 42 days.The results showed: The fermentation could partially degrade the levels of trypsin inhibitor,antigen protein and macromolecular protein in soybean meal,and increase the concentrations of crude protein and small peptide. Compared with the negative control group,after the 6% fish meal was replaced by the fermented soybean meal T468,P839，B356 and Y918,the weight gain rate ofLitopenaeusvannameiwere increased by 16.7%,12.0%,9.9%,11.9%,and the feed coefficient were significantly decreased by 18.1%、13.7%、12.6%、14.8%(P<0.05),which reached the similar levels of growth performance as the positive control group.Meanwhile,protein efficiency,protein retention,digestibilities of dry matter and protein of these groups were significantly higher than those of negative control group(P<0.05). Activities of hepatopancreas amylase and hemolymph SOD of each fermented soybean meal group was significantly higher than those negative control group(P<0.05),and activities of proteinase and hemolymph PO of P839 group were significantly higher than the negative control group(P<0.05).The above results indicated that the fermentation can improve the availability of soybean meal,and 6% fish meal can be replaced by fermented soybean meal provided that the growth and fodder utilization of Litopenaeus vannamei was not be affected.

Litopenaeusvannamei,fermented soybean meal,growth,nutrients utilization,activities of digestive enzymes,non-specific immunity

2015-09-09

彭松，男，1990年出生，碩士，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)

冷向軍，男，1972年出生，教授，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)

S963.7

A

1003-0174(2017)04-0103-08