童記強(qiáng) 黃惠莉 汪 泳 梁 芮

(華僑大學(xué)化工學(xué)院1，廈門 361021)(惠安瑞芳食品有限公司2，泉州 362131)

利用魚油制備甘油二酯的研究

童記強(qiáng)1黃惠莉1汪 泳2梁 芮1

(華僑大學(xué)化工學(xué)院1，廈門 361021)(惠安瑞芳食品有限公司2，泉州 362131)

以魚油為原料，研究了各因素對甘油二酯含量的影響。在無溶劑體系中，采用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM甘油解法合成甘油二酯，考察反應(yīng)溫度、底物摩爾比(甘油:粗魚油)、酶添加量、反應(yīng)時間對甘油二酯含量的影響。通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化試驗條件，確定最佳合成條件為：反應(yīng)溫度50 ℃、酶添加量為底物總質(zhì)量0.7%、底物摩爾比(甘油:粗魚油)為2.3∶1、反應(yīng)時間6 h，甘油二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到48.07%。通過對比粗魚油與甘油二酯的脂肪酸含量及組成，發(fā)現(xiàn)魚油甘油二酯既可以較好地保持魚油脂肪酸的組成優(yōu)勢，又可同時具有甘油二酯的特殊營養(yǎng)學(xué)特性。

魚油 甘油二酯 甘油解法 脂肪酸

甘油二酯(DAG)是一種新型的功能性油脂，具有防止肥胖、降低餐后血脂含量、防治高血脂、高血壓、心腦血管病等多項生理活性和功能[1-2]。甘油二酯與普通食用油在口感、外觀以及脂肪酸組成上基本相同[3-4]，富含甘油二酯的產(chǎn)品已被美國食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)為公認(rèn)安全物質(zhì)(GRAS)。甘油二酯作為一類多功能添加劑，在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[5]。

目前市場上甘油二酯食用油主要是以菜籽油、大豆油、棕櫚油、橄欖油和花生油等甘油三酯(TAG)型油脂制備而來[6-11]，以魚油為原料制備而成的甘油二酯還鮮有報道[12-15]。Kuroki等[16]研究表明，富含二十碳五烯酸 (EPA)的DAG能降低血糖水平，有可能作為防止與糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的臨床試劑；Eom等[17]的研究發(fā)現(xiàn)富含n-3 多不飽和脂肪酸(PUFA)的DAG可以有效地防止小鼠增重。因此，富含n-3 PUFA的DAG同時具備甘油二酯與n-3 PUFA的有益之處，不僅可以替代TAG食用油作為健康人群的保健用油，也可以用于肥胖人群以及相關(guān)并發(fā)癥人群的營養(yǎng)治療[15]。目前甘油解反應(yīng)合成甘油二酯所用催化劑一般有化學(xué)催化劑(如：氫氧化鈉、乙醇鈉、氧化鎂)和脂肪酶(常用的有Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)，采用化學(xué)催化劑的工藝簡單，但是對環(huán)境不友好，而且副產(chǎn)物多，后期純化成本高。利用酶催化制備甘油二酯，反應(yīng)條件溫和，能量消耗少，對環(huán)境友好，得到產(chǎn)物的顏色、風(fēng)味、口感等均具有良好品質(zhì)。

本研究以粗魚油為原料，用Lipozyme RM IM脂肪酶作為催化劑，在無溶劑體系中甘油解法合成甘油二酯，在分析各反應(yīng)因素對甘油二酯含量影響的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗設(shè)計獲得甘油二酯最佳制備工藝條件，為提高魚類加工副產(chǎn)品的附加值提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

粗魚油：廈門臺邁生物科技有限公司；油酸甘油單酯標(biāo)準(zhǔn)品、油酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品、油酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：美國SIGMA公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM：丹麥諾維信公司。

LC solution 15C高效液相色譜儀：日本島津公司；RID檢測器：色譜柱Sepax Bio-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；GCMC-QP 2010 Plus氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固定化脂肪酶Lipozyme RM IM催化魚油甘油解反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取一定底物摩爾比的甘油和魚油于100 mL燒杯中，將燒杯置于恒溫磁力攪拌器上預(yù)熱到一定溫度的水浴體系中，攪拌速度為150 r/min，并加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，反應(yīng)一段時間后，將反應(yīng)產(chǎn)物在8 000 r/min下離心5 min，除去固定化脂肪酶，取上層油樣低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高效液相色譜法檢測

取30 mg甘油二酯樣品，用1 mL乙腈∶異丙醇(60∶40，V/V)溶解，進(jìn)行高效液相色譜檢測其甘油二酯含量。色譜條件：流動相為乙腈∶異丙醇(V/V)為60∶40；采用等濃度梯度洗脫，柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min，洗脫時間為37 min；進(jìn)樣量20 μL。

以樣品峰的保留時間與油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，按峰面積歸一法計算甘油二酯和甘油三酯的含量。

1.2.3 氣質(zhì)聯(lián)用測脂肪酸組成

樣品甲酯化[18]：取2滴樣品于10 mL試管，加0.5 mol/L氫氧化鉀—甲醇溶液1.0 mL，搖勻，在60 ℃水浴中反應(yīng)30 min。取出冷卻至室溫，加入3 mL 14% 硫酸—甲醇溶液，搖勻，60 ℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫，加入3 mL正己烷提取上層溶液用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為Rtx-5Ms，載氣為高純氦(He)，柱箱溫度100 ℃，進(jìn)樣溫度 260 ℃，柱流量2.05 mL/min，分流比30∶1。質(zhì)譜條件：電離方式EI，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)荷比范圍：45.00～400.00 m/z，檢測器電壓：1 kV。升溫程序為：120 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫到200 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升溫到240 ℃，保持5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對甘油二酯的影響

由于甘油很難溶解在油脂中，對合成甘油二酯的反應(yīng)是不利的，為提高甘油與魚油的互溶性，促進(jìn)甘油解反應(yīng)的進(jìn)行，可以適當(dāng)?shù)靥岣叻磻?yīng)溫度。但溫度過高，則會影響酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，從而降低酶活力，所以試驗需控制適宜的反應(yīng)溫度。在底物摩爾比(甘油:粗魚油)為1∶1，加酶量為底物質(zhì)量的1%，反應(yīng)時間為10 h的條件下，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時進(jìn)行試驗，考察反應(yīng)溫度對甘油解反應(yīng)中DAG含量及TAG含量的影響，試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)溫度對DAG含量及TAG含量的影響

由圖1可知，反應(yīng)溫度從30～50 ℃時，產(chǎn)物中DAG的含量逐漸增加，TAG含量減少，這是由于升高溫度促進(jìn)了底物之間的互溶，促進(jìn)甘油解程度的增大，合成產(chǎn)物甘油二酯含量隨溫度的升高而增大。從50 ～70 ℃，DAG的含量變化不大。當(dāng)溫度在70 ℃，脂肪酶的酶活力還沒明顯喪失，主要是由于在幾乎沒有水的反應(yīng)體系中，由溫度升高而引起的酶因受熱失活在反應(yīng)體系中被大大削弱了，這也是非水相酶催化反應(yīng)的一個顯著的優(yōu)點[19]。隨著溫度的升高，甘油在反應(yīng)體系中的溶解度會有很大提高，但是酶長時間處于較高溫度下，容易達(dá)到酶變性的活化能，酶活性下降。綜合考慮底物的互溶性以及酶的活性，故試驗適宜反應(yīng)溫度選擇為50 ℃。

2.1.2 底物摩爾比對合成甘油二酯的影響

在脂肪酶催化合成反應(yīng)中，甘油與粗魚油的比例是決定甘油解產(chǎn)物組成的重要因素，底物摩爾比的改變會影響體系的穩(wěn)定性及產(chǎn)物的擴(kuò)散速率與含量。在反應(yīng)溫度為40 ℃，加酶量為底物質(zhì)量的1%，反應(yīng)時間為10 h的條件下，調(diào)節(jié)底物摩爾比(甘油:粗魚油)分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1時進(jìn)行試驗，考察底物摩爾比對甘油解反應(yīng)中 DAG含量以及TAG含量的影響，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 底物摩爾比對DAG含量及TAG含量的影響

在底物摩爾比(甘油∶粗魚油)為1∶2～2∶1范圍內(nèi)，隨著底物摩爾比的增加，DAG的含量明顯增加。說明當(dāng)甘油的含量逐漸增加時，促進(jìn)更多的魚油甘油解，過量的甘油增加酯化程度，使得反應(yīng)平衡向產(chǎn)物甘油二酯的方向移動。當(dāng)甘油和粗魚油的摩爾比達(dá)到2∶1以后，繼續(xù)增加甘油含量，DAG含量沒有明顯變化。Eom等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甘油和金槍魚魚油的最佳摩爾比為3∶1，這與本研究結(jié)果較為接近。在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜锬柋冗_(dá)到4∶1時，明顯有甘油剩余，因此繼續(xù)增加的甘油沒有參與反應(yīng)，故最適的底物摩爾比(甘油:粗魚油)選擇2∶1。

2.1.3 加酶量對合成甘油二酯的影響

在無溶劑體系中，脂肪酶的添加量是影響DAG合成率的一個因素。在反應(yīng)溫度為40 ℃，底物摩爾比(甘油∶粗魚油)為1∶1，反應(yīng)時間為10 h的條件下，調(diào)節(jié)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM的添加量分別為底物總質(zhì)量的0.1%、0.5%、1%、2%、3%進(jìn)行試驗，考察加酶量對甘油解反應(yīng)中DAG含量以及TAG含量的影響，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對DAG含量及TAG含量的影響

當(dāng)加酶量從0.1%加到2%時，TAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)從30.68%下降到了5%。當(dāng)加酶量超過2%之后，DAG和TAG含量變化不明顯。加酶量在0.1%～0.5%范圍內(nèi)，甘油二酯的含量明顯增加，這是因為隨著脂肪酶用量的增加，甘油解的速度加快，因此甘油二酯含量增加。當(dāng)加酶量超過1%后，產(chǎn)物中甘油二酯的含量卻不斷下降，Kristensen等[20]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)加酶量過多時，DAG的含量反而下降，這是因為過量的酶的降低了甘油解的程度，過量的酶可能會導(dǎo)致無規(guī)律的混合，從而增加對傳質(zhì)的限制。Duan等[21]認(rèn)為過量的酶導(dǎo)致生物催化劑結(jié)塊和可能存在擴(kuò)散問題，因此酶過量會使得DAG含量下降。當(dāng)加酶量為2%時，TAG含量最少，但此時的DAG含量卻不是很高，綜合考慮DAG含量以及經(jīng)濟(jì)問題，最適加酶量選擇0.5%。

2.1.4 酶解時間對合成甘油二酯的影響

當(dāng)體系反應(yīng)時間不同時，底物的甘油解反應(yīng)程度也不相同，因此反應(yīng)時間也是影響DAG合成率的因素之一。在反應(yīng)溫度為40 ℃，底物摩爾比(甘油∶粗魚油)為1∶1，加酶量為底物質(zhì)量的1%，調(diào)節(jié)反應(yīng)時間分別為2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行試驗，考察酶解時間對甘油解反應(yīng)中 DAG含量以及TAG含量的影響，試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時間對DAG含量及TAG含量的影響

反應(yīng)時間在2～6 h范圍內(nèi)，DAG的含量明顯增加，TAG含量減少，DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40.92%。當(dāng)反應(yīng)時間超過8 h后，整個反應(yīng)趨于平衡，TAG的和DAG含量都沒有明顯變化。這是由于甘油解反應(yīng)遵循化學(xué)平衡反應(yīng)的規(guī)律，反應(yīng)進(jìn)行一定時間后即達(dá)到平衡，在反應(yīng)體系達(dá)到平衡之后即使再增加反應(yīng)時間，轉(zhuǎn)化率也不會增加。當(dāng)反應(yīng)時間為6 h時，雖然DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較高，但此時TAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較高，為16.06%；10 h時TAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少，僅有8.02%。但是反應(yīng)時間越長，試驗的能耗越大，故在合理范圍內(nèi)應(yīng)盡量縮短反應(yīng)時間。因此綜合考慮DAG以及TAG的含量問題，最適反應(yīng)時間選擇8 h。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的試驗結(jié)果，選取反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、底物摩爾比(甘油∶粗魚油)、加酶量4個影響因素為自變量，以反應(yīng)產(chǎn)物中DAG的含量作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，運用Design Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。+1、0、-1分別代表四因素的高、中、低水平，設(shè)計響應(yīng)面因子及水平如表1所示，試驗設(shè)計及試驗結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面因子和水平

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

對表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得DAG含量的二次回歸方程為：

Y=45.13+0.39A-1.13B+1.43C+2.47D-0.79AB-0.94AC-0.53AD-2.45BC-1.98BD-0.18CD-2.42A2-1.35B2-3.22C2-1.52D2

表3 回歸模型方差分析表

2.3 最佳條件預(yù)測與驗證

根據(jù)Box-Behnken方法分析，得到甘油二酯含量最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50.13 ℃、脂肪酶添加量0.7%、底物摩爾比(甘油：粗魚油)為2.29∶1、時間6.00 h，此時DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)預(yù)測值為48.90%。將其最佳反應(yīng)條件調(diào)整為：反應(yīng)溫度50 ℃、脂肪酶添加量為0.7%、底物摩爾比(甘油∶粗魚油)2.3∶1、時間6 h，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗，得到平均值為48.07%，與理論值接近。說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的DAG含量數(shù)據(jù)可靠，具有預(yù)測使用價值。

2.4 甘油酯脂肪酸分析

粗魚油以及合成后DAG的脂肪酸如表4所示。

表4 粗魚油及甘油二酯的脂肪酸組成

從表4可看出，魚油的脂肪酸主要組分為棕櫚酸、油酸和棕櫚油酸。從粗魚油與合成的DAG的脂肪酸組成及含量可以看出，二者的種類及含量幾乎沒有變化，說明通過本試驗制備甘油二酯沒有破壞其中脂肪酸的組成，合成的魚油DAG能夠保持魚油原有的脂肪酸組成，這對魚油DAG的營養(yǎng)價值有重要的意義。

3 結(jié)論

本研究在無溶劑體系中，采用甘油解法，用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM催化魚油制備甘油二酯，所得產(chǎn)物采用高效液相分析其甘油二酯含量。通過對影響DAG產(chǎn)率反應(yīng)溫度、底物摩爾比、酶添加量、反應(yīng)時間的單因素試驗考察，結(jié)合Box-Behnken方法進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，確立了甘油解法制備魚油甘油二酯的最佳工藝條件：反應(yīng)溫度50 ℃、時間6 h、脂肪酶添加量0.7%、底物摩爾比2.3∶1，甘油二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.27%。通過對比粗魚油與甘油二酯的脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)脂肪酸含量及組成幾乎沒有變化，因此魚油甘油二酯既可以較好地保持魚油脂肪酸的組成優(yōu)勢，又可同時具有DAG的特殊營養(yǎng)學(xué)特性，為進(jìn)一步研究魚油甘油二酯提供參考，同時也可提高魚油的附加值。

[1]Saito S, Yamaguchi T, Shoji K, et al. Effect of low concentration of diacylglycerol on mildly postprandial hypertriglyceridemia[J]. Atherosclerosis, 2010, 213(2): 539-544

[2]Zheng M, Huang Q, Huang F, et al. Production of novel “Functional oil” rich in diglycerides and phytosterol esters with “One-pot” enzymatic transesterification[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(22): 5142-5148

[3]Morita O, Soni M G. Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil: A review of the published literature[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(1): 9-21

[4]劉小如，張超，胡蔣寧，等. 酶催化茶油合成甘油二酯工藝及脂肪酸變化[J]. 食品科學(xué)，2013, 34(2): 36-41 Liu X R, Zhang C, Hu J N,et al. Lipase-catalyzed synthesis of diacylglycerol from camellia oil and fatty acid profile change[J]. Food Science, 2013, 34(2): 36-41

[5]Guo Z, Sun Y. Solvent-free production of 1,3-diglyceride of CLA: Strategy consideration and protocol design[J]. Food Chemistry, 2007, 100(3): 1076-1084

[6]Daniela V D H, Andreas S, Rolf W, et al. Enzyme-assisted process for DAG synthesis in edible oils[J]. Food Chemistry, 2015, 176: 263-270

[7]Wang W, Li T, Ning Z, et al. Production of extremely pure diacylglycerol from soybean oil by lipase-catalyzed glycerolysis[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 49(2): 192-196

[8]Zulkurnain M, Lai O M, Latip R A, et al. The effects of physical refining on the formation of 3-monochloropropane-1,2-diol esters in relation to palm oil minor components[J]. Food Chemistry, 2012, 135(2): 799-805

[9]Craft B D, Nagy K, Seefelder W, et al. Glycidyl esters in refined palm (Elaeisguineensis) oil and related fractions. Part II: Practical recommendations for effective mitigation[J]. Food Chemistry, 2012, 132(1): 73-79

[10]吳克剛，孫敏甜，柴向華. 酶法制備花生油甘油二酯研究[J]. 糧食與油脂，2012(8): 16-19 Wu K G, Su M T, Cai X H, et al.Research on production of diacylglycerol from peanut oil using enzymatic process[J], Cereals & Oils, 2012(8): 16-19

[11]Krueger R L, Valerio A, Balen M, et al. Improvement of mono and diacylglycerol production via enzymatic glycerolysis in tert-butanol system[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2010, 112(8): 921-927

[12]Miranda K, Baeza-Jiménez R, Noriega-Rodríguez J A, et al. Optimization of structured diacylglycerols production containing ω-3 fatty acids via enzyme-catalysed glycerolysis of fish oil[J]. European Food Research and Technology, 2013, 236(3): 435-440

[13]Feltes M M C, Villeneuve P, Baréa B, et al. Enzymatic production of monoacylglycerols (MAG) and diacylglycerols (DAG) from fish oil in a solvent-free system[J]. Journal of The American Oil Chemists’ Society, 2012, 89(6): 1057-1065

[14]Feltes M M C, Oliveira J V, Treichel H, et al. Assessment of process parameters on the production of diglycerides rich in omega-3 fatty acids through the enzymatic glycerolysis of fish oil[J]. European Food Research and Technology, 2010, 231(5): 701-710

[15]葛玲，姚麗，周志陽，等. 富含n-3多不飽和脂肪酸的甘油二酯制備研究[J]. 食品工業(yè)， 2013(10): 107-110 Ge L, Yao L,Zhou Z Y, et al.Study on the production of diglycerides rich in n-3 polyunsaturated fatty acids[J]. The Food Industry, 2013(10): 107-110

[16]Kuroki T, Inoguchi T, Umeda F, et al. Effect of eicosapentaenoic acid on glucose-induced diacylglycerol synthesis in cultured bovine aortic endothelial cells [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 247(2): 473-477

[17]Eom T, Kong C, Byun H, et al. Lipase catalytic synthesis of diacylglycerol from tuna oil and its anti-obesity effect in C57BL/6J mice[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(5): 738-743

[18]郝苗，金黎明，姜波. 氣相色譜法測定鲅魚脂肪酸的含量[J]. 食品與藥品, 2007(10): 22-23 Hao M, Jin L M, Jiang B, et al.Determination of fatty acids in spanish mackerel by capillary gas chromatography[J]. Food and Drug, 2007(10): 22-23

[19]王衛(wèi)飛. 酶法甘油解合成甘油二酯工藝的研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2012 Wang W F. Study on synthesis of diacylglycerol by Lipase-catalyzed glycerolysis[D]. Guangzhou: South China University of Technology, 2012

[20]Kristensen J B, Xu X B, Mu H. Process optimization using response surface design and pilot plant production of dietary diacylglycerols by lipase-catalyzed glycerolysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005(53): 7056-7066[21]Duan Z, Du W, Liu D. Novozym 435-catalyzed 1,3-diacylglycerol preparation via esterification in t-butanol system[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(12): 1923-1927.

The Preparation of Diacylglycerol from Fish Oil

Tong Jiqiang1Huang Huili1Wang Yong2Liang Rui1
(College of Chemical Engineering, Huaqiao University1, Xiamen 361021)(Huian Ruifang Food Co., Ltd.2, Quanzhou 362131)

The fish oil was used as raw material and the influence of various factors on the diacylglycerol content was investigated. An immobilized lipase Lipozyme RM IM glycerinum solution was used to compound diacylglycerol.The influence of reaction temperature, substrate molar ratio (glycerol: fish oil), enzyme dosage and reaction time on diglyceride was investigated. The optimal synthesis condition were determined by response surface design test condition as follows: reaction temperature of 50 ℃, enzyme dosage accounting for 0.7% of total substrate mass, substrate molar ratio (glycerol: fish oil) 2.3∶1,and reaction time of 6 h. Under these conditions, the diacylglycerol mass fraction was 48.07%. Fish oil diacylglycerol could maintain better composition advantage of fish oil fatty acids and also had the special nutritional properties of the diacylglycerol by comparing fatty acid content and composition of crude fish oil and diacylglycerol.

fish oil, diacylglycerol, glycerolysis, fatty acids

福建省科技計劃重點項目(2013N0022)，泉州市科技計劃項目(2016N87)

2015-08-17

童記強(qiáng)，女，1989年出生，碩士，海洋水產(chǎn)資源開發(fā)利用

黃惠莉，女，1962年出生，教授，海洋水產(chǎn)資源開發(fā)利用

TS255.6

A

1003-0174(2017)04-0081-06