周中凱 王雨揚 刁永佳 王 芳

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

過度煎炸油脂對大鼠糖脂代謝及相關基因表達的影響

周中凱 王雨揚 刁永佳 王 芳

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

取24只生長狀況相同的Wistar雄鼠隨機分成3組，每天分別灌胃1.5 mL正常油脂、過度煎炸油脂，對照組灌胃等量的生理鹽水。4周后眼眶取血，6周后腹部主動脈取血，用于各項生化指標的檢測；取肝臟組織進行基因表達狀況的檢測。結果顯示：干預4周后，與對照組相比，正常油脂組血脂含量均有所升高，過度煎炸油脂組基本與對照組持平；干預6周后，正常油脂組甘油三酯高于對照組，而過度煎炸油脂組甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平均明顯低于對照組(P<0.01)。血糖水平在對照組、正常油脂組、過度煎炸油脂組呈逐漸增高趨勢。qPCR結果表明：短期食用過度煎炸油脂即會導致大鼠肝臟組織ACC、ACOX1基因顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，這說明過度煎炸油脂中的毒性物質(zhì)能通過影響脂肪酸正常的合成和代謝，造成機體脂肪酸合成代謝紊亂。同時Insig1基因明顯下調(diào)(P<0.01)，說明過度煎炸油脂會對機體糖代謝產(chǎn)生一定影響。

過度煎炸油 糖脂代謝 基因表達 qPCR

據(jù)統(tǒng)計，在一些經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)，接近一半的午餐和晚餐食品是煎炸食品，油炸食品由于其酥脆可口的特性而備受喜愛[1]。但是，油脂在煎炸過程中會發(fā)生復雜的品質(zhì)變化，主要通過一些氧化和分解反應(包括聚合、水解、異構化和環(huán)化等)產(chǎn)生很多極性物質(zhì)，這些物質(zhì)對機體有很強的毒害作用，并且隨著煎炸時間的延長會逐漸積累，攝入人體后會導致基因突變、染色體突變從而誘發(fā)癌癥如乳腺癌、結腸癌等[2]。隨著食品安全意識的普及,這逐漸成為消費者極其關心的食品安全問題,同時也是國內(nèi)外相關領域競相研究的熱點，因為煎炸油的健康與人類的健康密切相關[3]。

目前，國內(nèi)外對于油脂多次煎炸過程中的主要成分變化已經(jīng)有了非常深入的研究。李東銳等[4]以高級大豆烹調(diào)油和棕櫚油混合物為煎炸油，對其品質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)隨煎炸時間延長，煎炸油中的聚合物含量大大升高，黏度增大，不飽和脂肪酸含量下降，碘值、皂化值降低，酸值、過氧化值升高。Aladedunye等[5]研究煎炸過程中油脂的降解及營養(yǎng)品質(zhì)變化，結果表明，極性值、酸值、色澤和反式脂肪酸隨油炸溫度和時間的增加呈顯著性變化。近年來，國內(nèi)外對于油脂加熱過程中的成分變化已經(jīng)研究得相當深入，但是對于過度煎炸油脂攝入機體后如何影響自身代謝的研究卻很少。本試驗采用健康成年大鼠，通過每天攝入一定量的煎炸油脂，來研究其對機體糖脂代謝的影響，以及對于體內(nèi)一些糖脂基因信號通路的作用，這對于我們更加深入地了解煎炸油對機體的毒害作用，指導人們綠色健康飲食都具有十分深遠的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性SPF級成年Wistar成年大鼠32只：購自人民解放軍軍事科學醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK-(軍)2012-0004，體重290～310 g，于天津科技大學SPF級動物實驗研究中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，正常采光；自由攝食進水，飼喂基礎飼料。動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》，并經(jīng)過天津科技大學動物飼養(yǎng)管理中心認可。

1.1.2 儀器與試劑

MK-3酶標儀：美國Thermo公司；Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機：Heal Force Development Ltd公司；Mx-3000pTM實時熒光定量PCR儀：吉泰生物科技有限公司；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司；Thermo 991超低溫冰箱：美國Thermo公司。

優(yōu)質(zhì)食品級大豆油：市售；血清甘油三脂(TG)、總膽固醇(TCH)試劑盒：浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒：南京建成生物制劑有限公司；羅氏血糖儀活力型：Sanmina-SCI公司；RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、One Step SYBR RT-PCR kit：寶生物生物工程(大連)有限公司；PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及處理

將24只Wistar大鼠隨機分為3組，每組8只，分別為：對照組、正常油脂組、過度煎炸油脂組。實驗動物在適應性喂養(yǎng)1周后，各組動物分別灌胃等量的生理鹽水、正常油脂(未經(jīng)任何處理的食品級大豆油)、過度煎炸油脂開始干預，1.5 mL/d，與此同時，自由進食基礎飼料，共干預6周。

為模擬多次煎炸過程中油脂主要成分的變化，并且研究一些淀粉、蛋白類食物煎炸后產(chǎn)生的毒性物質(zhì)對機體的影響，參照Kuligowski等[6]制備煎炸油脂的方法并進行改進，具體做法為：將原樣大豆油加熱后(控制在190 ℃左右)，間歇性煎炸薯條、雞排、魚丸、雞翅、薯片、饅頭片等，每天煎炸5～6 h，如此重復約1周，制備過度煎炸油脂。

1.2.2 飲食條件

試驗過程中對動物提供充足的基礎飼料，正常進食進水。飼料成分表見表1。

表1 動物飼料成分表

1.2.3 各指標的測試方法

血清血脂相關指標的檢測：干預4周時對動物麻醉、固定，眼眶取血1.5 mL；干預6周后，禁食不禁水12 h后，腹部主動脈取血，同時取肝臟組織，斷頸處死。全血靜置2～3 h后，在高速冷凍離心機中3 500 r/min離心15 min，用移液器吸取上層血清分裝到eppendorf管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用試劑盒法測定動物血清中血脂指標的含量，每組8個樣品，3組共計24個樣品。指標測試嚴格按照試劑盒說明書要求，每個樣品重測3次。血糖指標測定嚴格按照羅氏血糖儀操作要求進行，測定大鼠非空腹狀態(tài)下血糖水平，每個樣本測3次取平均值。

血糖水平的檢測：固定大鼠，對其尾尖消毒后，用取血針取1滴血，點在血糖試紙上，迅速在血糖儀記下示數(shù)，每只大鼠每次測3次取平均值。

基因的mRNA表達量：采用總RNA提取試劑盒提取大鼠肝臟組織總RNA，嚴格按照試劑盒說明書操作，之后將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于后續(xù)的實時熒光定量PCR的測定。以18S基因為內(nèi)參基因，每次從3個試驗組中個取1個樣本進行試驗，每個指標重復測定3次，相當于1個基因檢測9只大鼠。qPCR條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，退火溫度60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)后72 ℃ 10 min，試驗分別記錄每個樣品的Ct值，試驗采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，計算各基因相對表達量：

R=2(Ct Calibrator (GOI)-Ct Unknown (GOI))/2

[Ct Calibrator (RefGene)-Ct Unknown (RefGene)]

式中：Unknown為試驗組；Calibrator為對照組；GOI 為目的基因；RefGene為內(nèi)參基因。表達變化情況通過試驗組與對照組的比值(倍數(shù))表示出來。選取的內(nèi)參基因(18S)及目的基因的引物序列見表2。

表2 用于實時定量PCR的引物序列表

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果與討論

2.1 油脂干預對大鼠血清中血脂水平的影響

如表3所示，連續(xù)干預4周后3組大鼠血清中的血脂水平均發(fā)生了變化。其中TG、TCH含量過度煎炸油脂組水平基本和對照組相等，而正常油脂組動物血清中的含量略有升高；HDL-C含量在對照組、正常油脂組、過度煎炸油脂組之間呈微弱增長趨勢，過度煎炸油脂組反而顯著升高(P<0.05)。這說明在短時間干預后正常油脂和過度煎炸油脂均不會大幅改變大鼠血清血脂水平，過度煎炸油毒性還未引起受試動物生命體征的明顯波動。而在連續(xù)干預6周之后，正常油脂組血脂含量基本和對照組持平，只有TG和HDL-C含量稍有下降；而過度煎炸油脂組的血脂成分則發(fā)生了顯著變化，其中TG、TCH和HDL-C較其他2組極其顯著性下降(P<0.01)。同時，正常油脂組HDL-C的差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可見長期過量攝入正常油脂也會在一定程度上影響機體健康。

2.2 油脂干預對大鼠血糖水平的影響

圖1 干預4/6周后大鼠血糖的變化

分別在第4周和第6周測定大鼠血清中血糖含量(非空腹)，血糖水平如圖1所示。結果表明，正常油脂和過度煎炸油脂均會使大鼠血糖略微升高，但是只有過度煎炸油脂組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。此外，從變化趨勢來看，過度煎炸油脂的對增加血糖幅度最大，尤其在長時間食用過度煎炸油脂后對機體血糖水平會有較大的影響，但正常油脂的攝入對機體血糖水平的影響也不容忽視。

2.3 qPCR檢測各組大鼠肝組織中相關mRNA的表達量

乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)和乙酰輔酶A氧化酶(ACOX1)均出現(xiàn)了在正常油脂組上調(diào)，在煎炸油脂組下調(diào)的現(xiàn)象，而膽固醇調(diào)節(jié)原件結合蛋白(SREBP1)在2組油脂試驗組均出現(xiàn)了明顯下調(diào)(P<0.01)，且下調(diào)量基本相等。由于機體在形成細胞膜脂肪層以及以脂肪的形式儲存能量時需要合成脂肪酸，而乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸合成代謝中的限制性酶，在哺乳動物脂肪酸合成代謝中起著十分重要的作用。由圖2可見正常油脂能促進ACC基因表達，加速脂肪酸合成代謝，而煎炸油脂導致ACC基因表達的顯著性下調(diào)(P<0.05)，這可能是由于煎炸油中一些毒性化合物嚴重干預ACC基因的表達，從而造成脂肪酸合成代謝受阻。另外，ACOX1基因在脂肪酸β氧化代謝脂中發(fā)揮著關鍵性的作用，在過度煎炸油脂組出現(xiàn)了明顯下調(diào)，這進一步說明該試驗組正常的脂肪酸代謝受到破壞，而正常油脂對肝臟脂肪酸代謝影響不大。脂肪酸合成酶基因(FAS)在2組油脂試驗組均未出現(xiàn)明顯變化，說明該脂肪酸合成途徑未受到顯著性影響。Kadota等[7]研究表明正常血脂譜的遺傳變異與相關血脂基因在DNA水平上差異表達有關，這些差異可通過影響血脂脂肪酸和膽固醇的合成和代謝而影響血脂的水平，而SREBP1基因作為一種膜結合轉(zhuǎn)錄因子，可以增強膽固醇、脂肪酸、三羧酸甘油酯生物合成酶基因的轉(zhuǎn)錄，本研究發(fā)現(xiàn)在膳食中適當提高脂肪的攝入會顯著降低SREBP1基因的表達，相關機理需做進一步的研究。

圖2 mRNA的相對表達量

表3 不同試驗條件持續(xù)干預4/6周后大鼠血脂相關指標的變化/mmol/L

注：*表示與對照組對比具有顯著差異(P<0.05)，**表示與對照組對比差異極顯著(P<0.01)。

Insig1、Insig2基因是胰島素誘導基因，在葡萄糖代謝平衡中具有重要作用，同時也能調(diào)節(jié)細胞膽固醇和脂類代謝[8]，從圖2結果可以看出試驗組均受到較大影響，尤其是對于Insig1基因影響，煎炸油脂的干預顯著性地降低其表達水平(P<0.01)，這說明煎炸油脂在較大程度上會影響機體胰島素的分泌和糖代謝水平。

3 結論

在較短的時期內(nèi)食用過度煎炸油即會導致大鼠肝臟組織ACC、ACOX1基因顯著性下調(diào)，這可能是由于其中的毒性物質(zhì)會對機體造成明顯損傷，從而影響脂肪酸正常的合成和代謝，繼而影響機體的正常生命活動。同時食用過度煎炸油脂也會導致胰島素誘導基因1(Insig1)明顯下調(diào)，影響機體糖代謝。結果還顯示，適當?shù)靥岣哂椭臄z入量便會導致SREBP1、Insig1基因下調(diào)，這均會對機體的糖脂代謝造成不同的影響。

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Effect of Deep-Frying Edible Oil on Glucose and Lipid Metabolism and Its Related Gene Expression in Rats

Zhou Zhongkai Wang Yuyang Diao Yongjia Wang Fang
(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457)

24 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups, in which each rate was

with an equal amount of 1.5 mL of saline，normal oils, and deep-frying oils, respectively. Each rate in the control group was received with equal normal saline. Their bloods were taken from the eyes and abdominal after 4 weeks and 6 weeks, respectively for detection of various biochemical indexes. Liver tissues were used for relative gene expression detecting. The results showed that the normal serum lipid content increased in each group compared with that of control group, its content in deep-frying oils group was very close to the control group after 4 weeks intervention. While the triglyceride (TG) content in the normal oil group was higher than that in the control group, TG, total cholesterol, and high-density lipoprotein levels in deep-frying oil group were significantly lower than that of the control group

after 6 weeks’ intervention (P<0.01). There was an increasing tendency in the blood glucose level of the control group, normal oils group and deep-frying oils group. The results of quantitative real-time PCR showed that after the long-term consumption of deep-frying oils, the ability to regulate the ACC and ACOX1 genes in liver tissues was declined (P<0.05 orP<0.01), which indicated that toxic substances in deep-frying oils could result in synthesis and metabolism disorder of fatty acid by influencing normal synthesis and metabolism of fatty acid. At the same time, the Insig1 gene was decreased significantly (P<0.01), which indicated that deep-frying oils would have a certain effect on the body’s glucose metabolism.

deep-frying oils, glucose and lipid metabolism, gene expression, quantitative real-time PCR

國家自然科學基金(31471701)

2015-08-01

周中凱，男，1964年出生，教授，糧油科學與營養(yǎng)

TS221

A

1003-0174(2017)04-0070-05