齊倩倩， 常明則， 張格娟， 李 斌， 史文珍， 李仕林， 田 曄

雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用

齊倩倩， 常明則， 張格娟， 李 斌， 史文珍， 李仕林， 田 曄

目的 探討雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷(oxygen and glucose deprivation,OGD)的作用。方法 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，分為正常組、OGD組、溶劑組和1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素組，OGD同時(shí)給予雷帕霉素處理，8 h后通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化以及LDH活性檢測(cè)細(xì)胞受損程度。結(jié)果 與正常組相比，單純OGD組細(xì)胞活性明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與溶劑組相比，1、10、100、500 nmol雷帕霉素組細(xì)胞存活率均存在不同程度的增高，其中10、100、500 nmol組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷具有保護(hù)作用。

PC12細(xì)胞； OGD； 雷帕霉素

腦梗死是導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，存活者50%～70%患者遺留有嚴(yán)重殘疾，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1,2]。然而，腦梗死至今仍缺乏安全有效的治療措施，目前應(yīng)用的溶栓治療雖然具有肯定效果，但是因其嚴(yán)格的時(shí)間限制和出血等嚴(yán)重并發(fā)癥使其應(yīng)用受限。因此積極尋找有效的治療藥物勢(shì)在必行。雷帕霉素是從吸水鏈霉菌屬中提煉出來(lái)的一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其最初作為一種抗真菌藥物使用[3～5]。近年來(lái)有研究表明，雷帕霉素在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮著保護(hù)作用，但是其在腦梗死中的作用仍不明確。本文采用PC12細(xì)胞氧糖剝奪模型，給予不同濃度的雷帕霉素干預(yù)，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞存活率的變化，探討雷帕霉素在PC12細(xì)胞OGD損傷中是否發(fā)揮保護(hù)作用；為腦梗死治療提供新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 1640培養(yǎng)基、MTT、胎牛血清和胰酶均購(gòu)于西安依科生物有限公司，DMSO、馬血清購(gòu)于Sigma公司； Rapamycin，購(gòu)于Cayman Chemical公司；真空干燥器，四川蜀牛公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Sellab公司；倒置激光共聚焦顯微鏡FV300，Olympus公司；超凈工作臺(tái)，Airtech公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Biotek公司；96孔板震蕩儀，Thermo公司；多溫度式水浴鍋，上海精宏公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及其分組 PC12細(xì)胞，購(gòu)于上海中科院；選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，隨機(jī)分為以下7組：正常組、單純OGD組、溶劑組和1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素組。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+5%胎牛血清+10%馬血清+1%青霉素-鏈霉素100×)，置于37 ℃、95% CO2、5% O2孵箱中培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2 OGD模型的建立 選取生長(zhǎng)狀況良好的PC12細(xì)胞，消化離心后以適宜的密度接種于96孔板或者培養(yǎng)瓶中。把含血清的培養(yǎng)液換成無(wú)糖無(wú)血清的Hepes緩沖液，然后將96孔板或培養(yǎng)瓶放在缺氧裝置中(裝置見(jiàn)圖1)。用電動(dòng)吸痰器抽盡裝置內(nèi)的空氣，然后小流量充入氮?dú)夂投趸幕旌蠚怏w，最后放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時(shí)間。

2.3 MTT 選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，按照4×105密度，200 μl接種于96孔板中。每孔加入20 μl的MTT溶液，錫箔紙避光，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后取出96孔板，小心吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO，在96孔板震蕩儀中震蕩10 min，充分溶解紫色結(jié)晶。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)各孔的吸光度值(OD)，選取波長(zhǎng)為490 nm，記錄結(jié)果。

2.4 LDH 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測(cè)，在一定程度上可判斷細(xì)胞受損情況。LDH在正常情況下存在活細(xì)胞胞漿中，在缺氧等應(yīng)激環(huán)境中可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，胞漿中的LDH即被釋放到細(xì)胞外，LDH釋放量與細(xì)胞的死亡數(shù)近似成正比，與吸光度成正比。因此，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放量，可以反映細(xì)胞的損傷程度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 OGD模型的成功建立 正常情況下，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形，細(xì)胞透光性強(qiáng)，貼壁生長(zhǎng)；單純OGD組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞漂浮，貼壁細(xì)胞胞體略變小，透光性較差(見(jiàn)圖2A)。MTT結(jié)果顯示：與正常組相比，單純OGD組細(xì)胞相對(duì)活性下降約43%，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，證明OGD模型成功建立(見(jiàn)圖2B)。LDH活性檢測(cè)法得到的結(jié)果與MTT比色法趨勢(shì)一致，與正常組相比，單純OGD組LDH活性增加約6倍，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3.2 雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷具有保護(hù)作用 與單純OGD組相比，溶劑組細(xì)胞形態(tài)學(xué)并未發(fā)生明顯改變，細(xì)胞數(shù)量也沒(méi)有明顯減少，說(shuō)明DMSO對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒副作用。與溶劑組相比，雷帕霉素組細(xì)胞數(shù)量明顯增多，形態(tài)呈不規(guī)則狀(見(jiàn)圖3A)。與正常組相比，單純OGD組和溶劑組細(xì)胞存活率均明顯下降，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單純OGD組和溶劑組兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3B)。與溶劑組相比，雷帕霉素組細(xì)胞存活率增加(P<0.05)。

3.3 不同濃度雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷的保護(hù)作用 與正常組相比，單純OGD組細(xì)胞密度減少，部分細(xì)胞漂浮，細(xì)胞變小形態(tài)變圓，狀態(tài)較差。不同濃度雷帕霉素組的細(xì)胞數(shù)量比溶劑組增多，且以100 nmol濃度的雷帕霉素最明顯(見(jiàn)圖4A)。MTT結(jié)果顯示：與正常組相比，單純OGD組細(xì)胞活性下降約50%；與溶劑組相比，10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素組細(xì)胞的存活率均有不同程度的升高(P<0.05)，其中100 nmol作用最明顯(見(jiàn)圖4B)。LDH活性檢測(cè)也得到了類似趨勢(shì)，與正常組相比，單純OGD組LDH釋放量增加約6倍。與溶劑組相比，10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素處理組LDH的釋放量均不同程度的降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖4C)。同樣100 nmol作用最明顯，且P<0.001，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 OGD裝置示意圖

圖3 A：雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后形態(tài)學(xué)的影響。B：雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后存活率的影響。Vehicle=DMSO，標(biāo)尺=50 μm，n=3，與control比較*P<0.05;與Vehicle比較#P<0.05

圖4 A：不同濃度雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。B：不同濃度雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后存活率的影響。C：不同濃度雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞OGD損傷后LDH活性的影響。Vehicle=DMSO，n=3，與control比較*P<0.05，**P<0.001；與Vehicle比較#P<0.05，##P<0.001

4 討 論

本文中采用的OGD裝置是本課題小組自制，其具有密閉性良好、體積小和操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)，可以較好地模擬腦缺血。

雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最初作為抗真菌藥物而應(yīng)用于臨床，后來(lái)又逐漸發(fā)現(xiàn)了其它功能，如免疫抑制作用和抗增殖特性等等。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中具有保護(hù)作用[6～8]。在腦缺血損傷領(lǐng)域中雖然也有相關(guān)的研究，但是關(guān)于雷帕霉素的作用尚未統(tǒng)一，仍然存在爭(zhēng)議。因此，仍然需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)明確雷帕霉素在腦缺血損傷中的作用。2011年Chauhan A等研究者發(fā)現(xiàn)在SD大鼠MCAO模型中，成功建模1 h后給予不同濃度的雷帕霉素(50 g/kg、150 μg/kg、250 μg/kg)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)給予150 μg/kg、250 μg/kg雷帕霉素實(shí)驗(yàn)組大鼠受損的運(yùn)動(dòng)功能得到改善，并且顯著地逆轉(zhuǎn)了丙二醛、谷胱甘肽、一氧化氮和髓過(guò)氧化物酶等炎癥因子水平的增加，從而發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用[9]。Tomasz Urbanek等研究者發(fā)現(xiàn)，在HUVEC細(xì)胞OGD同時(shí)給予100 nmol雷帕霉素干預(yù)6 h后，提高了細(xì)胞存活率。由此可見(jiàn)，上述研究者均認(rèn)為雷帕霉素在腦梗死動(dòng)物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。然而也有部分研究者持相反觀點(diǎn)，認(rèn)為雷帕霉素加劇了腦缺血損傷。2015年Weiner GM等研究者發(fā)現(xiàn)在胎鼠原代神經(jīng)元OGD模型中，OGD同時(shí)給予雷帕霉素干預(yù)，雷帕霉素組細(xì)胞LDH釋放量增加，說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)條件下雷帕霉素是加重神經(jīng)元損傷的。同時(shí)在體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雷帕霉素

增加了腦梗死體積[11]。Maria Dolores P等研究者發(fā)現(xiàn)在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型中，給予雷帕霉素干預(yù)后加劇了細(xì)胞的死亡[12]。關(guān)于雷帕霉素在腦缺血損傷中矛盾的角色，可能與模型建立、研究對(duì)象、給藥時(shí)間、給藥濃度和研究條件的不同有一定的關(guān)系。

在本實(shí)驗(yàn)中，PC12細(xì)胞OGD 8 h后，與正常組相比，單純OGD組細(xì)胞存活率下降約50%。而給予1 nmol、10 nmol、100 nmol、500 nmol雷帕霉素干預(yù)后，與溶劑組相比，細(xì)胞存活率均存在不同程度的增高，100 nmol組細(xì)胞存活率最高。其中10、100、500 nmol均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在本實(shí)驗(yàn)中，濃度為10 nmol、100 nmol和500 nmol的雷帕霉素對(duì)PC12細(xì)胞的OGD損傷均具有保護(hù)作用，且以100 nmol作用最為明顯。在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，本課題小組將繼續(xù)探討雷帕霉素發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，為雷帕霉素的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

[1]Johnston SC,Mendis S,Mathers CD.Global variation in stroke burden and mortality:estimates from monitoring,surveillance,and modelling[J].Lancet Neurol,2009,8(4):345-354.

[2]Na W,Lin X,Rui X,et al.MicroRNA-9 mediates the cell apoptosis by targeting Bcl2l 11 in ischemic stroke[J].Molecular Neurobiol,2015,53(10):6809-6817.

[3]Maiese K.Cutting through the complexities of mTOR for the treatment of stroke[J].Current Neurovascular Res,2014,11(2):177-186.

[4]Zhao ZC,Yao Q,Li HH.The rationale of targeting mammalian target of rapamycin for ischemic stroke[J].Cellular Signalling,2013,25(7):1598-1607.

[5]BovéeJ,Martinez-Vicente M,Vila M.Fighting neurodegeneration with rapamycin:mechanistic insights[J].Nature Rev Neurosci,2011,12(8):437-452.

[6]Pan T,Kondo S,Wen Z,et al.Neuroprotection of rapamycin in lactacystin-induced neurodegeneration via autophagy enhancement[J].Neurobiol Dis,2008,32(1):16-25.

[7]Sarkar S,Krishna G,Imarisio S,et al.A rational mechanism for combination treatment of Huntington’s disease using lithium and rapamycin[J].Human Molecular Genetics,2008,17(2):170-178.

[8]Khurana V,Lu Y,Steinhilb ML,et al.TOR-mediated cell-cycle activation causes neurodegeneration in a drosophila tauopathy model[J].Current Biology Cb,2006,16(3):230-241.

[9]Chauhan A,Sharma U,Jagannathan NR,et al.Rapamycin protects against middle cerebral artery occlusion induced focal cerebral ischemia in rats[J].Behavioural Brain Res,2011,225(2):603-609.

[10]Urbanek T,Kuczmik W,Basta-Kaim A,et al.Rapamycin induces of protective autophagy in vascular endothelial cells exposed to oxygen-glucose deprivation[J].Brain Res,2014,1553(6):1-11.

[11]Weiner GM,Ducruet AF.Mammalian target of rapamycin (mTOR) activity promotes neuronal survival in stroke with or without ischemic postconditioning[J].Neurosurgery,2015,76(2):19-20.

[12]Maria Dolores P,Isaac GY,Noelia F,et al.mTOR/S6 kinase pathway contributes to astrocyte survival during ischemia[J].J Biological Chemist,2009,284(33):22067-22078.

The effect of rapamycin on PC12 cells injured by oxygen and glucose deprivation

QIQianqian,CHANGMingze,ZHANGGejuan,etal.

(DepartmentofNeurology,Xi’anNo.3Hospital,Xi’an710018,China)

Objective To investigate the effect of rapamycin on PC12 cells injured by oxygen and glucose deprivation.Methods The PC12 cells which in the logarithmic phase were randomly divided into control,OGD,vehicle,1,10,100,500 nmol rapamycin groups.Rapamycin was added to the medium directly at the start of OGD.We observed the morphology changes of PC12 cells by inverted microscope after OGD,evaluated the survival rate of PC12 cells challenged with the MTT assay.Results Compared with the control group,the PC12 cells activity of OGD group was significantly decreased (P<0.05),compared with the vehicle group,the cell survival rates of 1,10,100,500 nmol rapamycin groups were increased in a varying degrees,and cell survival rates of the 10,100,500 nmol have statistically significant (P<0.05).Conclusion Rapamycin has a protective effect in OGD injury of PC12 cells.

PC12 cell; OGD; Rapamycin

1003-2754(2017)06-0494-03

2016-12-15；

2017-03-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.H0906)；陜西省自然科學(xué)基金(No.2014JM4139)

(陜西省西安市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710018)

田 曄，E-mail：chhty@sina.com

R743.3

A