張璐，李安迪，2，楊楠，2，蔣葭葭，孫玉潔，2*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，南京 211166；2.江蘇省人類(lèi)功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211166)

卵巢顆粒細(xì)胞中胰島素和雄激素對(duì)芳香化酶和5α-還原酶1影響的研究

張璐1，李安迪1，2，楊楠1，2，蔣葭葭1，孫玉潔1，2*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，南京 211166；2.江蘇省人類(lèi)功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211166)

目的 研究卵巢顆粒細(xì)胞中胰島素對(duì)睪酮激素轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響。 方法 選用人卵巢顆粒細(xì)胞瘤樣細(xì)胞系(KGN)作為研究對(duì)象。應(yīng)用RT-PCR分析KGN細(xì)胞在梯度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)及胰島素(1、10、100 ng/ml)處理4 h后CYP19a1和5RD5A1 mRNA水平；Western-blot檢測(cè)高濃度睪酮(10、20 ng/ml)及梯度胰島素處理KGN細(xì)胞24 h后芳香化酶和5α-還原酶1蛋白水平；同步收集上清，應(yīng)用放射性免疫法及酶聯(lián)免疫法檢測(cè)培養(yǎng)液上清睪酮、雌二醇及雙氫睪酮的濃度。 結(jié)果 胰島素劑量依賴(lài)性地上調(diào)CYP19a1的表達(dá)和活性，增加睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化；同時(shí)抑制5RD5A1的表達(dá)和活性，抑制睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化比例改變但消耗水平不變，導(dǎo)致睪酮的異常累積。 結(jié)論 高雄激素環(huán)境下，胰島素可通過(guò)影響睪酮轉(zhuǎn)化酶促使睪酮轉(zhuǎn)化異常。本實(shí)驗(yàn)為高胰島素及高雄激素水平在卵巢微環(huán)境相互作用加劇PCOS病程提出了可能的機(jī)制。

顆粒細(xì)胞瘤樣細(xì)胞系； 胰島素； 睪酮； 芳香化酶； 5α-還原酶1

(JReprodMed2017，26(7)：711-717)

在卵巢顆粒細(xì)胞中，睪酮不僅可以向雌二醇轉(zhuǎn)化，也可向雙氫睪酮轉(zhuǎn)化。5α-還原酶1是將卵巢和其他組織中的睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮的關(guān)鍵酶，由5RD5A1基因所編碼。5RD5A1發(fā)揮功能的最適pH比較廣泛[14-15]，而5RD5A2是在一個(gè)狹窄的酸性最適pH下發(fā)揮功能[15-16]，在卵巢中5α-還原酶1為主要作用酶。5α-還原酶1表達(dá)水平和活性降低會(huì)導(dǎo)致睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化被抑制，因而推斷可能這條轉(zhuǎn)化途徑發(fā)生異常導(dǎo)致PCOS患者卵巢局部出現(xiàn)睪酮異常累積。另?yè)?jù)報(bào)道，大約60%～70%的PCOS患者具有胰島素抵抗的癥狀并伴隨有代償性的高胰島素血癥[17-18]，卵泡在高胰島素環(huán)境下對(duì)FSH刺激的敏感性明顯增強(qiáng)，使顆粒細(xì)胞合成過(guò)多的雌二醇。而胰島素對(duì)于睪酮向雙氫睪酮轉(zhuǎn)化的影響目前缺少明確報(bào)道。PCOS患者具有高雄激素水平的同時(shí)也伴隨著高胰島素水平，因而猜想高胰島素水平能夠?qū)е滦奂に剞D(zhuǎn)化異常，本研究選擇卵巢顆粒細(xì)胞瘤樣細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探討高胰島素水平是否在促進(jìn)睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的同時(shí)抑制睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致睪酮的異常累積。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象：人顆粒細(xì)胞瘤樣細(xì)胞系(Human granulose-like tumor cell line，KGN)，由母義明教授惠贈(zèng)。

2.主要試劑：DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))；胎牛血清(GIBCO，美國(guó))；β-Actin抗體(Sigma，美國(guó))；芳香化酶抗體(Santa Cruz，美國(guó))；5α-還原酶1抗體(Abcam，美國(guó))；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz，美國(guó))；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz，美國(guó))；HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗(Santa Cruz，美國(guó))；睪酮，胰島素(Sigma，美國(guó))。

二、方法

1.人顆粒細(xì)胞瘤樣細(xì)胞系KGN培養(yǎng)：KGN細(xì)胞以10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(青霉素200 U/ml；鏈霉素100 μg/ml)條件培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，應(yīng)用含0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)·Na2的0.1% 胰酶消化，終止消化后細(xì)胞以3×105個(gè)/孔種于3.5 cm皿中。待細(xì)胞貼壁后，換含0.2% BSA的無(wú)酚紅的DMEM/F12饑餓培養(yǎng)12 h。分別按照空白對(duì)照組、梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理組、梯度濃度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)進(jìn)行加藥，處理4 h和24 h用于檢測(cè)CYP19a1和5RD5A1 mRNA及蛋白水平的變化；睪酮 (10、20 ng/ml)和胰島素(1、10、100 ng/ml)合并處理4 h及24 h進(jìn)行相同檢測(cè)；24 h組同步檢測(cè)培養(yǎng)液上清中睪酮、雌二醇及雙氫睪酮的濃度。

對(duì)于物流配送企業(yè)來(lái)說(shuō)，在高水平地滿(mǎn)足客戶(hù)對(duì)時(shí)間要求的前提下實(shí)現(xiàn)配送成本最低是其追求的主要目標(biāo)，這就需要通過(guò)物流配送路徑優(yōu)化來(lái)實(shí)現(xiàn)。從配送中心到特定客戶(hù)配送活動(dòng)可以通過(guò)運(yùn)用科學(xué)的物流配送路徑優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)企業(yè)的人工調(diào)度和車(chē)輛安排合理化，使得其運(yùn)作效率更高的情況下，配送成本也能夠得到很好的控制，使物流配送企業(yè)獲得更有持續(xù)發(fā)展能力、更健康的發(fā)展前景。

2.RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)：采用Trizol法提取RNA，測(cè)濃度后以500 ng為模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix，TAKARA，日本)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)CYP19a1和5RD5A1 mRNA表達(dá)水平。Real-time PCR按照(Roche Fast Start Universal SYBR Green Master，Roche，瑞士)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，計(jì)算方法如下：ΔCt=Ct(目的基因)—Ct Actin；ΔΔCt=ΔCt(處理組)—ΔCt(對(duì)照組)；轉(zhuǎn)錄水平=2-ΔΔCt×100%。引物合成序列如表1所示。

表1 引物序列

3.蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(Western blot)：細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解提取蛋白，全程在冰上操作，運(yùn)用BCA蛋白檢測(cè)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗4℃孵育過(guò)夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemiscope 350V，上海勤翔)檢測(cè)，Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描檢測(cè)。目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參蛋白的灰度值校正誤差，得到目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4.放射性免疫實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：處理細(xì)胞的上清液經(jīng)收集后以12 000 r/min在4℃離心10 min，取上清分裝凍存在-80℃。睪酮及雌二醇水平采用I125標(biāo)記的放射性免疫法測(cè)定，依照購(gòu)于中國(guó)北方生物技術(shù)有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用γ測(cè)量?jī)x檢測(cè)。雙氫睪酮采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)的步驟使用酶標(biāo)儀檢測(cè)(BioTek，美國(guó))，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)ALPCO公司。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行比較，組內(nèi)兩兩之間比較采用q檢驗(yàn)；以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰島素對(duì)KGN細(xì)胞CYP19a1和5RD5A1表達(dá)的影響

使用單純的梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理KGN細(xì)胞4 h，胰島素濃度的選擇以低于、近似及高于人的生理濃度胰島素為參照[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10及100 ng/ml的胰島素能夠顯著上調(diào)CYP19a1的mRNA表達(dá)(P<0.05)，而5RD5A1的mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯變化(P>0.05)(圖1A)；梯度濃度的胰島素處理KGN細(xì)胞24 h時(shí)，檢測(cè)芳香化酶以及5α-還原酶1的蛋白表達(dá)水平(圖1B)，胰島素(10、100 ng/ml)能夠上調(diào)芳香化酶蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)，而且劑量依賴(lài)性下調(diào)5α-還原酶1蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)(圖1C)。結(jié)果提示，胰島素上調(diào)CYP19a1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，對(duì)5RD5A1的mRNA水平無(wú)顯著影響，但能夠抑制其蛋白水平的表達(dá)。

A：Real-time PCR檢測(cè)梯度濃度胰島素處理KGN細(xì)胞4 h后 CYP19a1及5RD5A1 mRNA水平；B～C：Western blot檢測(cè)梯度濃度胰島素處理KGN細(xì)胞24 h的芳香化酶和5-α還原酶1的蛋白水平；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01 圖1 胰島素處理KGN細(xì)胞中CYP19a1和 5RD5A1 mRNA及蛋白水平

二、睪酮對(duì)KGN細(xì)胞CYP19a1及5RD5A1表達(dá)的影響

應(yīng)用梯度濃度睪酮(1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)處理KGN細(xì)胞4 h，CYP19a1的mRNA水平呈睪酮?jiǎng)┝刻荻纫蕾?lài)性升高，在5、10、20 ng/ml劑量組均有顯著上升(P<0.05)；而5RD5A1的mRNA并沒(méi)有明顯變化(P>0.05)(圖2A)。同樣的，選取梯度濃度睪酮處理KGN細(xì)胞24 h，檢測(cè)睪酮對(duì)芳香化酶及5α-還原酶1蛋白水平的影響(圖2B)，結(jié)果顯示隨著濃度的升高，睪酮對(duì)芳香化酶及5α-還原酶1均顯示劑量依賴(lài)性上調(diào)作用(P<0.05)(圖2C)。

A：Real-time PCR檢測(cè)梯度濃度睪酮處理KGN細(xì)胞4 h后CYP19a1和5RD5A1的mRNA水平；B～C：Western blot檢測(cè)梯度濃度睪酮處理KGN細(xì)胞24 h芳香化酶及5α-還原酶1的表達(dá)水平；與睪酮0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖2 睪酮處理KGN細(xì)胞中CYP19a1和 5RD5A1 mRNA及蛋白水平

三、高雄激素環(huán)境下，胰島素對(duì)KGN細(xì)胞CYP19a1及5RD5A1表達(dá)的影響

使用高濃度睪酮(10、20 ng/ml)模擬高雄激素環(huán)境，合并梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理KGN細(xì)胞4 h和24 h，檢測(cè)CYP19a1和5RD5A1的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示高濃度睪酮存在的情況下，胰島素處理能夠進(jìn)一步劑量依賴(lài)性上調(diào)CYP19a1基因的表達(dá)(P<0.05)(圖3A)；同時(shí)劑量依賴(lài)性下調(diào)5RD5A1 mRNA的表達(dá)(圖3B)。與mRNA結(jié)果一致，Western blot(圖3 C、D、E)結(jié)果顯示高胰島素濃度能夠促進(jìn)芳香化酶蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)，且在睪酮20 ng/ml處理組更明顯；同時(shí)劑量依賴(lài)性抑制5α-還原酶1蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)，同樣在高濃度睪酮20 ng/ml處理組更為明顯。

四、高雄激素環(huán)境下胰島素對(duì)睪酮轉(zhuǎn)化作用的影響

在睪酮(10、20 ng/ml)合并梯度濃度胰島素(1、10、100 ng/ml)處理24 h情況下，同步收集了細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)睪酮及睪酮的兩個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(雌二醇和雙氫睪酮)的水平。結(jié)果顯示，上清中雌二醇的水平隨著胰島素濃度呈劑量依賴(lài)性增加(P<0.05)(圖4C)；雙氫睪酮的濃度在睪酮(20 ng/ml)處理時(shí)隨著胰島素濃度增高而降低(P<0.05)(圖4B)；而細(xì)胞培養(yǎng)上清未經(jīng)轉(zhuǎn)化的剩余睪酮濃度在梯度胰島素處理的情況下并沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)(圖4A)。

討 論

PCOS是影響育齡期婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂性疾病，主要表現(xiàn)在雄激素過(guò)多及排卵功能障礙，同時(shí)也存在胰島素抵抗及高胰島素血癥等代謝異常。目前胰島素抵抗在PCOS作用多集中在外周及經(jīng)典的靶器官，卵巢局部雄激素水平與胰島素抵抗的相互關(guān)系仍待研究。

胰島素抵抗被認(rèn)為是PCOS發(fā)病的核心因素，具有胰島素抵抗的患者會(huì)伴隨有代償性的高胰島素血癥。據(jù)報(bào)道，PCOS患者外周血中的胰島素水平和雄激素水平呈正相關(guān)關(guān)系[20]，然而兩者在卵泡液中的相關(guān)性并不明確。高水平的胰島素可以刺激促性腺激素細(xì)胞激活而介導(dǎo)雌鼠不育；抑制胰島素信號(hào)之后可以明顯改善肥胖誘導(dǎo)的雌鼠不育[21]。在卵巢中，胰島素的作用包括促進(jìn)激素合成、刺激葡萄糖代謝、影響基因轉(zhuǎn)錄等。據(jù)報(bào)道，高胰島素能夠直接刺激卵巢膜細(xì)胞中雄激素合成酶—P450C17，促進(jìn)雄激素生成[12]；同時(shí)能夠降低雄激素結(jié)合球蛋白的產(chǎn)生[9]，從而增加游離睪酮的濃度。其機(jī)制可能是通過(guò)胰島素作用于垂體的胰島素受體，增強(qiáng)黃體生成素釋放并促進(jìn)卵巢[10]和腎上腺[11]分泌雄激素。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍—胰島素增敏劑—可改善高胰島素血癥，進(jìn)而降低雄激素水平，最終導(dǎo)致雌二醇水平的降低，促進(jìn)卵泡有序生長(zhǎng)[7，22]。在卵巢顆粒細(xì)胞中，胰島素能夠上調(diào)芳香化酶的表達(dá)，促進(jìn)睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化[23]，而這種刺激作用可能是由胰島素生長(zhǎng)因子受體直接調(diào)節(jié)的。

A：Real-time PCR檢測(cè)高濃度睪酮合并胰島素處理KGN細(xì)胞中CYP19a1的mRNA水平；B：Real-time PCR檢測(cè)高濃度睪酮合并胰島素處理KGN細(xì)胞中5RD5A1的mRNA水平；C～E：Western blot檢測(cè)高雄激素水平下胰島素處理KGN細(xì)胞的芳香化酶及5α-還原酶1的表達(dá)水平；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01,睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖3 高雄激素環(huán)境下胰島素處理KGN細(xì)胞中CYP19a1和5RD5A1 mRNA和蛋白水平

A：培養(yǎng)液上清中睪酮的濃度；B：培養(yǎng)液上清中雙氫睪酮的濃度；C：培養(yǎng)液上清中雌二醇的濃度；與胰島素0 ng/ml處理組比較，*，#P<0.05，**，##P<0.01 睪酮換算至法定單位nmol/L，系數(shù)為0.0347圖4 高雄激素環(huán)境下胰島素對(duì)睪酮轉(zhuǎn)化作用的影響

高胰島素與高雄激素血癥一直是研究的熱點(diǎn)。睪酮也會(huì)影響到一些組織和細(xì)胞的胰島素敏感性，在培養(yǎng)女性脂肪細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)睪酮能夠降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，不論是在胰島素基底水平還是較高水平都有這種作用[24-25]。所以高胰島素和高雄激素之間是相互影響的。雄激素對(duì)于卵巢正常功能的發(fā)揮和女性生殖能力是必須的，對(duì)卵泡募集和生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但過(guò)量的雄激素可致大量卵泡閉鎖。在高濃度的睪酮長(zhǎng)期處理的鼠模型中，出現(xiàn)了大量卵泡閉鎖的現(xiàn)象[4]，與PCOS婦女人群出現(xiàn)的多囊卵巢類(lèi)似。關(guān)于PCOS的高雄激素血癥的發(fā)病機(jī)制目前有多種解讀，主要為高胰島素血癥、卵巢膜細(xì)胞的活性過(guò)度增強(qiáng)造成的雄激素合成過(guò)多。而本研究對(duì)睪酮的轉(zhuǎn)化與高雄激素水平的維持增加了新的認(rèn)識(shí)。

總之，本研究結(jié)果表明，在高雄激素環(huán)境的卵巢顆粒細(xì)胞中，高胰島素一方面上調(diào)CYP19a1基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化；另一方面抑制5RD5A1基因和蛋白的表達(dá)，睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化被抑制；睪酮轉(zhuǎn)化成雌二醇和雙氫睪酮的比例改變，但消耗并未增加，造成睪酮的異常“累積”。根據(jù)本結(jié)果可以推斷，卵巢局部高胰島素是導(dǎo)致卵巢局部維持高雄激素水平和高雌激素水平的重要誘因，為PCOS患者卵巢局部的高雄激素微環(huán)境的產(chǎn)生提出了新的機(jī)制，未來(lái)可在臨床中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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[編輯：羅宏志]

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《生殖醫(yī)學(xué)雜志》編輯部

Double-faced functions of insulin on CYP19a1 and 5RD5A1 under hyperandrogenism in ovarian granulosa cell

ZHANGLu1，LIAn-di1，2，YANGNan1，2，JIANGJia-jia1，SUNYu-jie1，2*

1.DepartmentofCellBiology，NanjingMedicalUniversity，Nanjing2111662.KeyLaboratoryofHumanFunctionalGenomicsofJiangsuProvince，Nanjing211166

Objective：To explore the effect of insulin on the aromatase (CYP19A1) and 5α-reductase1 (5RD5A1) under hyperandrogenism during the process of testosterone (T) transformation.

Methods：The mRNA expression levels of CYP19A1 and 5RD5A1 were measured by quantitative real-time PCR after 4 hours treatment of gradient insulin(1，10，100 ng/ml)and T (1.25，2.5，5，10，20 ng/ml) in KGN cells，and the protein expression of aromatase and 5α-reductase1 were detected by Western blot.Meantime，the supernatants of the cells were collected，and then T and estradiol(E2) levels were detected by radioactive immunoassay (RIA)，and dihydrotestosterone (DHT) was measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

Results：Insulin enhanced the aromatase expression in a concentration dependent manner.And this effect was elevated under the environment of high levels of T (10 and 20 ng/ml)，thus increasing the conversion of T to E2.Meanwhile，higher concentration of insulin suppressed the conversion of T to DHT through down-regulation of 5RD5A1 mRNA and protein level.The double effects lead to abnormal accumulation of testosterone.

Conclusions：High level of insulin defects T transformation process by affecting the aromatase and 5α-reductasse1.Our data offered a possible mechanism which interaction between hyperinsulinemia and hyperandrogenism exacerbates polycystic ovary syndrome (PCOS) condition.

KGN cell； Insulin； Aromatase； 5α-reductase 1； Testosterone

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.018

2017-03-06；

2017-03-19

國(guó)家科技部重點(diǎn)973 項(xiàng)目(2012CBA01306)

張璐，女，山東滕州人，碩士，細(xì)胞生物學(xué)專(zhuān)業(yè).(*

，Email：yujiesun@njmu.edu.cn)