劉國廠

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450006）

運(yùn)動(dòng)飲料中糖分的檢測(cè)

劉國廠

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450006）

建立一種用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)法測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中常用的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種糖分的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈-水提取，過濾膜后上機(jī)檢測(cè)。采用ZORBAX糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水梯度洗脫作為流動(dòng)相，用蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，10種糖組分在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.996～0.999，檢出限為 0.02 mg/mL～0.1 mg/mL，定量限為 0.06 mg/mL～0.3 mg/mL，加標(biāo)回收率達(dá)到 90.2%～98.5%。

高效液相色譜；運(yùn)動(dòng)飲料；糖

運(yùn)動(dòng)飲料是根據(jù)人體運(yùn)動(dòng)的生理消耗而配置的，通過合理補(bǔ)充營養(yǎng)代謝物質(zhì)使運(yùn)動(dòng)員抗疲勞能力提高，優(yōu)化肌肉和肝糖原儲(chǔ)備，維持血糖穩(wěn)定，促進(jìn)疲勞的消除，來提高運(yùn)動(dòng)能力。運(yùn)動(dòng)飲料中主要含有碳水化合物，電解質(zhì)，維生素，氨基酸等成分，能補(bǔ)充人體所需的營養(yǎng)成分，抗疲勞，平衡新陳代謝[1]。其中碳水化合物就包括糖類物質(zhì)，它的添加在給飲用人群提供能量的同時(shí)，也帶給人們更好的感官享受。在我國標(biāo)準(zhǔn)GB 15266-2009《運(yùn)動(dòng)飲料》[2]中，雖然未對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中的糖分作出限量，但是針對(duì)特殊人群的飲料，有必要了解其中的糖含量以及糖的種類，以便更好安排攝入食品種類數(shù)量，防止高糖分給帶來身體危害。

本試驗(yàn)就針對(duì)此，測(cè)定其中常見的10種糖分即木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)的含量。目前，食品中糖含量的測(cè)定有滴定分析法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-7]和離子色譜法[8-9]等，但結(jié)合糖類物質(zhì)自身易溶于水、低揮發(fā)性、不易電離等特點(diǎn)，液相色譜法是目前較理想、實(shí)用的檢測(cè)方法。液相色譜方法中示差折光檢測(cè)器依據(jù)折射率的變化對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，極易受溫度、流動(dòng)相梯度等條件的影響，導(dǎo)致譜圖基線漂移，靈敏度偏低，實(shí)際應(yīng)用并不理想。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）基于樣品顆粒對(duì)光的散射與質(zhì)量呈指數(shù)關(guān)系進(jìn)行測(cè)定，與被測(cè)物質(zhì)的官能團(tuán)和光學(xué)性質(zhì)無關(guān)[11-13]，且受溫度、梯度洗脫等試驗(yàn)條件影響小，適合于無紫外吸收或只有紫外末端吸收、低揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200series高效液相色譜儀：美國Agilent，Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：美國Agilent。

木糖標(biāo)準(zhǔn)品、果糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)購買市場(chǎng)上銷售的運(yùn)動(dòng)飲料。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX NH2糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 流動(dòng)相體系對(duì)糖分色譜行為的影響

固定流動(dòng)相流速1.2 mL/min，考察不同的流動(dòng)相組成以及不同洗脫模式對(duì)10種糖的分離效果。

1.4.2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的條件優(yōu)化

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的兩個(gè)較重要的參數(shù)分別是漂移管溫度和載氣流速，兩者對(duì)組分的保留時(shí)間影響較小，但對(duì)信噪比（S/N）的影響較大，一般建立適當(dāng)?shù)母咝б合?蒸發(fā)光散射檢測(cè)器分析方法時(shí)，需對(duì)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 g/100 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)飲料中除了固有的一些食品基質(zhì)外，還含有很多的人為添加的營養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對(duì)前處理要求高，所以本試驗(yàn)樣品前處理對(duì)3種不同的提取液Ⅰ：甲醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅱ：乙醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅲ：乙腈-水（1∶1，體積比）進(jìn)行比較，以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以市售運(yùn)動(dòng)食品為基質(zhì)，加入10種糖分的混標(biāo)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

食品中糖類檢測(cè)比較常用的色譜柱有NH2柱、C18柱以及鈣型陽離子柱。因此，本試驗(yàn)比較了這3種不同的色譜柱，發(fā)現(xiàn)NH2糖分析柱更具有優(yōu)勢(shì)，10個(gè)目標(biāo)物質(zhì)峰基本都能出峰，而C18柱、鈣型陽離子柱這兩種色譜柱分析的譜圖效果不理想。這是由于在這10種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分析中，由于NH2柱的特殊鍵合力，能與不同糖分子形成氫鍵的結(jié)合力強(qiáng)弱不同，在分離時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)。所以本試驗(yàn)選擇NH2柱進(jìn)行10種糖的分析色譜柱。

2.2 流動(dòng)相體系對(duì)糖分色譜行為的影響

由于ELSD在霧化過程中需將流動(dòng)相及樣品溶劑揮發(fā)，形成被測(cè)樣品微顆粒進(jìn)行散射光檢測(cè)，因此，試驗(yàn)中一般不使用不易揮發(fā)的緩沖鹽（如乙酸銨等）進(jìn)行色譜行為的調(diào)節(jié)。試驗(yàn)考察等度模式洗脫下不同組分及比例的流動(dòng)相組成Ⅰ：甲醇∶水=60∶40（體積比）；流動(dòng)相Ⅱ：乙腈∶水=60∶40（體積比）；流動(dòng)相Ⅲ：乙腈∶水=70∶30（體積比），流動(dòng)相Ⅳ：乙腈 ∶水=80∶20（體積比），以及梯度洗脫條件下對(duì)10種糖分分離效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 The chromatogram of mixed standard solution

結(jié)果表明：等度洗脫的模式下，乙腈與甲醇相比，乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，比較適合多組分目標(biāo)物的洗脫分離；在乙腈-水流動(dòng)相中，水的比例對(duì)容量因子影響顯著，隨水含量的增加，各組分保留時(shí)間明顯提前，容量因子逐步減小。其中流動(dòng)相Ⅳ：乙腈∶水=20∶70（體積比）的分離度最好，但仍有組分不能分開；所以選擇乙腈-水的流動(dòng)相組成，嘗試在梯度模式的洗脫條件下，通過優(yōu)化乙腈-水的比例，最終條件為：0～1 min，80%乙腈；1 min～5 min，90%乙腈；5 min～20 min，75%乙腈；20 min～35 min，80%乙腈。此條件下10種組分可以等到可得到良好的基線分離。

2.3 ELSD條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同載氣流速（載氣壓力）0.8 L/min，1.0、1.2、1.4、1.6 L/min 和不同漂移管溫度 40、50、60、70℃對(duì)檢測(cè)響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明：載氣流速對(duì)響應(yīng)值的影響比漂移管溫度對(duì)響應(yīng)值的影響明顯。結(jié)合試驗(yàn)中液相色譜的流量，合理的載氣流速可以保證被測(cè)樣品微霧滴的有效形成。漂移管溫度的調(diào)節(jié)更多地體現(xiàn)在對(duì)基線噪聲的影響上。當(dāng)被測(cè)樣品以微霧滴形式進(jìn)入漂移管時(shí)，比表面積的大幅增加使溶劑的揮發(fā)溫度遠(yuǎn)低于通常的沸點(diǎn)，隨著溫度的升高，目標(biāo)物峰面積的變化趨緩，噪聲增加，信噪比反而下降，結(jié)果見圖2。

圖2 不同漂移管溫度和不同載氣流速條件下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 The chromatograms of mixed standard solution in different drift tube temperatures and different flow rates of carrier gas

保持漂移管溫度60℃，以0.05 g/100 mL 10種糖分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比（S/N）考察最佳載氣流速。結(jié)果表明：載氣流速過小，霧化不充分，過大則可能導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，信號(hào)值降低。載氣流速由0.8 L/min升至1.6 L/min時(shí)，各組分的信噪比隨載氣流速呈拋物線變化；當(dāng)載氣流速為1.2 L/min時(shí)，信噪比達(dá)到最高，試驗(yàn)選擇載氣流速為1.2 L/min。保持載氣流速為1.2 L/min，調(diào)節(jié)不同漂移管溫度，考察0.05 g/100 mL下10種糖分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積變化情況。結(jié)果表明：漂移管溫度在40℃～70℃之間時(shí)，峰面積呈下降趨勢(shì)，但幅度不明顯，尤其高于60℃后變化更趨平緩，考慮到溫度太低溶劑揮發(fā)不完全，基線不穩(wěn)，試驗(yàn)選擇漂移管溫度為60℃。綜合以上考慮，經(jīng)過試驗(yàn)摸索，確定最佳漂移管溫度為60℃，最佳載氣流速為1.2 L/min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證10種糖分在乙腈-水流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 g/100 mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，10種糖分在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到10種目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.02 mg/mL～0.1 mg/mL和0.06 mg/mL～0.3 mg/mL，結(jié)果見表 1。

表1 10種糖分的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of ten kinds sugar

2.5 提取液的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[10，13]，針對(duì)于樣品提取液的選擇，分別選用提取液Ⅰ：甲醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅱ：乙醇-水（1∶1，體積比）、提取液Ⅲ：乙腈-水（1∶1，體積比）來進(jìn)行比較，分別稱取2.0 g試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入提取液定容至刻度，旋渦振蕩2min，用0.45 μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中供液相色譜測(cè)定。

試驗(yàn)結(jié)果以10種糖分的平均回收率為比較依據(jù)，結(jié)果見圖3，乙腈-水（1∶1，體積比）作為提取液效果最好，10種糖分的平均回收率較好。

2.6 樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收

在隨機(jī)抽取的20個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料中，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后儀器條件，選擇乙腈-水（1∶1）溶液提取，過濾后上機(jī)檢測(cè)結(jié)果見圖4。

結(jié)果表明：在所檢測(cè)的運(yùn)動(dòng)飲料樣品中，果糖值在13.5 mg/g～24.6 mg/g之間，葡萄糖值在12.3 mg/g～20.5 mg/g之間，半乳糖值在1.6 mg/g～10.8 mg/g之間，蔗糖值在9.4 mg/g～56.5 mg/g之間，麥芽糖值在0.2 mg/g～2.4 mg/g之間，乳糖值在5.8 mg/g～25.9 mg/g之間，木糖，蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖均未檢出。結(jié)果見圖4，是兩種運(yùn)動(dòng)飲料中糖分的分析色譜圖。加標(biāo)回收試驗(yàn)中，在加標(biāo)濃度為0.50 g/100 mL的飲料樣品中，10種糖分的加標(biāo)回收率在90.2%～98.5%之間，符合檢測(cè)要求。

圖3 提取液選擇對(duì)10種糖分平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate for the ten kinds sugar

圖4 部分實(shí)際樣品分析色譜圖Fig.4 Analysis chromatogram of part real samples

2.7 與國標(biāo)方法測(cè)定值的比較

在本試驗(yàn)測(cè)定的20個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)飲料中，將其中含有蔗糖的兩個(gè)樣分別采用GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的測(cè)定》的第二法（酸水解滴定法）和GB/T 22221-2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定高效液相色譜法》（該標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜-示差折光法）進(jìn)行測(cè)定比較，見表2。

從表2中可以看出本法測(cè)定結(jié)果與GB/T 22221-2008結(jié)果更為吻合，以mg/g為單位，GB/T 5009.8-2008（第二法）只能精確到整數(shù)位，特別是濃度較低時(shí)，準(zhǔn)確性不如高效液相色譜法。因此本法操作簡(jiǎn)單、方便快速、準(zhǔn)確性高，可以滿足運(yùn)動(dòng)飲料中糖類的成分和含量測(cè)定的要求。

表2 本法測(cè)定的樣品中蔗糖含量與國標(biāo)方法測(cè)定值的比較Table 2 Comparison of sucrose detection results by this method and national methods

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種糖同時(shí)分離檢測(cè)的方法。結(jié)果表明，在乙腈-水流動(dòng)相體系梯度洗脫條件：0～1 min，80%乙腈；1 min～5 min，90%乙腈；5 min～20 min，75%乙腈；20 min～35 min，80%乙腈，載氣流速為1.2 L/min、漂移管溫度60℃的條件下木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等10種組分能得到良好的基線分離，且在0.01 g/100 mL～0.50 g/100 mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，10種目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為 0.02 mg/mL～0.1 mg/mL 和 0.06 mg/mL～0.3 mg/mL。樣品在經(jīng)提取液：乙腈-水（1∶1，體積比）的提取下，10種糖分的加標(biāo)回收率在90.2%～98.5%之間，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的凈化，準(zhǔn)確有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中的糖分含量及種類，可為運(yùn)動(dòng)人群更好地了解攝入食物的營養(yǎng)成分提供參考。

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Analysis Sugar in Sports Drink

LIU Guo-chang
（Huanghe Science&Technology College，Zhengzhou 450006，Henan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of ten sugars（xylose，fructose，glucose，galactose，sucrose，maltose，lactose，1-kestose，nystose，1F-Fructofuranosyl nystose）in sports drink by high performance liquid chromatography-ELSD detection method.The samples were extracted by acetonitrilewater，and detected on the machine after filtering membrane.The separation of targeted compound was performed on a ZORBAX sugar analysis chromatography column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water as mobile phase，with ELSD detector and external standard method peak area quantification.The linear range of ten kinds sugar was in the range of 0.01 g/100 mL-0.50 g/100 mL with a correlation coefficient of 0.996-0.999.The detection limit was 0.02 mg/mL-0.1 mg/mL and the quantitative limit was 0.06 mg/mL-0.3 mg/mL.The recovery rate was 90.2%-98.5%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；sugar

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.034

劉國廠（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育教育訓(xùn)練學(xué)。