周帥，張飛云

（西安交通大學(xué)城市學(xué)院，陜西西安710018）

UPLC-MS/MS檢測運動食品中β-受體激動劑殘留

周帥，張飛云

（西安交通大學(xué)城市學(xué)院，陜西西安710018）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅10種β-受體激動劑殘留的分析方法。樣品前處理用乙腈沉淀蛋白后，采用MCX小柱進行凈化和富集。采用Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分離，以0.1%甲酸-乙腈為流動相的梯度洗脫模式下，β-受體激動劑在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.993～0.999，檢出限為 0.5 μg/kg，定量限為 1.5 μg/kg，加標(biāo)回收率達到 78.2%～91.8%。該方法具有前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和檢測速度快的優(yōu)點，適用于運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑殘留的分離和定量檢測。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；運動食品；β-受體激動劑

β-受體激動劑是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，國內(nèi)養(yǎng)殖戶一般將其添加到動物飼料中去，這樣能夠提高飼養(yǎng)動物的胴體瘦肉率，從而賣出好價錢。但是若人體食用含有過量β-受體激動劑藥物的動物源性食品后，將會引發(fā)惡心、嘔吐、激動、失眠、食欲減退等一系列不良反應(yīng)[1-2]，所以農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定在所有動物源性食品中不得檢出此類藥物[3]。但一些不法商販為獲取經(jīng)濟利益，仍然非法使用該類藥物，這對購買的消費者是一種潛在的危害。所以以動物源性為材料的運動食品也有可能存在β-受體激動劑藥物殘留的可能，且對此類運動食品中多種β-受體激動劑藥物的殘留研究報道不多，故本試驗對此類動物源性運動食品進行檢測研究。

目前常見的β-受體激動劑藥物有西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等。檢測方法也有很多，主要有酶聯(lián)免疫測定法、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography tandem mass spectrometry ，LC-MS/MS）等[4-9]。已有的方法常有靈敏度不高，前處理煩瑣、檢測藥物單一或重現(xiàn)性不好等問題，很難滿足對藥物殘留的同時確證檢測。本試驗所用的方法結(jié)合了超高效液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強的優(yōu)勢。特別是在前處理階段采用固相萃取技術(shù)，對于復(fù)雜樣品的分析檢測，不僅可以避免基質(zhì)干擾等問題，而且可以起到一個富集目標(biāo)物的作用，分析鑒定以往難于辨識的痕量成分。本方法針對10種β-受體激動劑類藥物殘留建立了一種快速簡便、專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，在實驗室的推廣可行性較高，可為動物源性運動食品中10種β-受體激動劑類藥物殘留的監(jiān)督檢驗和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司Agilent 1290，四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司API4000；

西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅10種標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈為色譜純：美國Fisher Scientific公司。

1.2 超液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相 A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～2.0 min 80%A；2.0～5.5 min 80%A →30%A；5.5～8.0 min 30%A→80%A；8.0 min 80%A。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對各個目標(biāo)物進行母離子全掃描，然后對其子離子進行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行質(zhì)譜儀分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

動物源性運動食品中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪類物質(zhì)，食品基質(zhì)復(fù)雜，對前處理要求高，本試驗以目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為比較依據(jù)，對幾種常用的提取溶劑以及固相萃取小柱，進行比較，選擇較優(yōu)的前處理條件。

1.3.4 加標(biāo)回收試驗及樣品測定

以市售未檢測出β-受體激動劑藥物的運動食品為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件和儀器條件，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，分別對濃度為10 ng/mL的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎(chǔ)上，對其子離子進行全掃描，選擇兩組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓5 500 V、離子源溫度500℃、氮氣流量30 L/min、掃描停滯時間100 ms，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10種β-受體激動劑的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

續(xù)表1 10種β-受體激動劑的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 1 Mass spectrometric parameters for 10 β-agonist drugs

依照表1所設(shè)定質(zhì)譜和超高效液相色譜的條件，選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring mode，MRM）進行檢測，10種β-受體激動劑能在10 min內(nèi)快速分離，結(jié)果如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗證西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅在優(yōu)化好的儀器條件中的線性關(guān)系，配制了濃度為 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機進行檢測。試驗結(jié)果表明，10種β-受體激動劑在1.0 ng/mL～20.0 ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99），并得到10種目標(biāo)組分的LOD均為 0.5 μg/kg，LOQ 均為 1.5 μg/kg，結(jié)果見表 2。

2.3提取溶劑的選擇

圖110 種β-受體激動劑的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of 10 β-agonist drugs

在對西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種目標(biāo)物提取的過程中，目標(biāo)物易被運動食品中的蛋白質(zhì)所吸附，所以在前處理過程中既要考慮蛋白質(zhì)的去除也要避免目標(biāo)物被蛋白質(zhì)沉淀所吸附。本試驗參考相關(guān)文獻[10-15]，比較了0.2 mol/L乙酸銨溶液、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等4種提取溶劑對10種目標(biāo)物的提取效果，具體結(jié)果見圖2。

表2 10種β-受體激動劑的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 10 β-agonist drugs

圖2 提取液對10種β-受體激動劑平均回收率的影響Fig.2 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 β-agonist drugs

結(jié)果如圖2所示，4種提取溶劑中，當(dāng)乙酸銨溶液以及乙酸乙酯作為提取溶劑時，樣品中的蛋白質(zhì)沉淀不充分，提取液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象；當(dāng)乙醇和乙腈為提取溶劑時，樣品中的蛋白質(zhì)沉淀效果明顯，提取液易于分離，其中乙醇提取率不及乙腈，乙腈的提取效果最好，回收率最高，所以本試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 固相萃取柱的選擇

運動食品中的基質(zhì)成分復(fù)雜，特別是以動物源性的運動食品中，即使是經(jīng)乙腈提取后的提取液中也含有很多雜質(zhì)干擾目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)。所以本試驗采用固相萃取小柱對提取液進行進一步的凈化和富集，并比較了常用的硅膠小柱、中性氧化鋁小柱、MCX小柱、HLB小柱以及C18小柱等5種固相萃取小柱對10種β-受體激動劑的凈化效果，結(jié)果以10種目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率作為比較依據(jù)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比較其他幾款小柱，MCX小柱對樣品提取液的凈化效果最好，加標(biāo)回收率最高。主要是因為在酸性條件下，MCX小柱能夠吸附具有一定弱堿性的β-受體激動劑，淋洗液淋洗雜質(zhì)后，再用堿性有機溶劑進行洗脫，洗脫液較為干凈，雜質(zhì)少，能對提取液起到很好的凈化效果。

2.5 加標(biāo)回收與相對偏差

在上述優(yōu)化后的前處理條件儀器條件下，利用空白基質(zhì)的樣品進行加標(biāo)回收率試驗，在分別添加0.5、5.0、20.0 μg/kg等3個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表3。

表3 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表3可見，10種β-受體激動劑的加標(biāo)回收率為78.2%～91.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～3.9%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 實際樣品的測定

利用本試驗優(yōu)化后處理方法及檢測方法，對市場上隨機購買的20個批次動物源性運動食品進行測定，結(jié)果良好，未發(fā)現(xiàn)上述10種β-受體激動劑的殘留。并且利用農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[16]，對適用于該標(biāo)準(zhǔn)的9種β-受體激動劑進行復(fù)檢，結(jié)果20個批次動物源性運動食品也未檢測出陽性樣品，表明該方法實際可行，可用于實際樣品的測定。

3 結(jié)論

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測動物源性運動食品中西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑殘留的分析方法。結(jié)果表明，通過優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，在MRM掃描模式下，10種β-受體激動劑組分能在10 min實現(xiàn)快速分離檢測。樣品經(jīng)過乙腈提取后，提取液再采用MCX小柱可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)，可實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的凈化與富集，能準(zhǔn)確快速有效地檢測動物源性運動食品中的西馬特羅、特步他林、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅等10種β-受體激動劑的藥物殘留。

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Analysis β-Agonist Drugs Residues in Sports Food by UPLC-MS/MS

ZHOU Shuai，ZHANG Fei-yun
（Xi'an Jiaotong University City College，Xi'an 710018，Shaanxi，China）

A ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was established for the residues determination of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.After treated with acetonitrile，the sample concentrated and purified by MCX solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm×150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of β-agonist drugs components was in the range of 1.0 ng/mL-20.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.993-0.999.The detection limit was 0.5 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg.The recovery rate was 78.2%-91.8%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，and is suitable for the separation and quantitative detection of cimaterol，terbutaline，salbutamol，fenoterol，rackdopamine，clorprenaline，clenbuterol，tulobuterol，phenylethanolamine A and penbutolol in sports food.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；sports food；β-agonist drugs

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.033

周帥（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：運動訓(xùn)練。