孫婕，尹國(guó)友，王超，王琦，李文建，張現(xiàn)青

（1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山467036；2.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036；3.加拿大農(nóng)業(yè)與食品部圭爾夫研究與發(fā)展中心，加拿大安大略圭爾夫N1G5C9）

混合發(fā)酵法制備韭籽粕水溶性膳食纖維

孫婕1，尹國(guó)友1，王超2，王琦3，李文建1，張現(xiàn)青1

（1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山467036；2.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036；3.加拿大農(nóng)業(yè)與食品部圭爾夫研究與發(fā)展中心，加拿大安大略圭爾夫N1G5C9）

采用混合發(fā)酵法，從韭籽粕中制備水溶性膳食纖維。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定料液比、發(fā)酵時(shí)間、混合菌體積比例和接種量的最適水平，再通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件?；旌习l(fā)酵法制備韭籽粕水溶性膳食纖維的最佳工藝為：料液比為1∶20（g/mL），發(fā)酵時(shí)間72 h，混合菌體積比例2∶1，接種量為10%，水溶性膳食纖維的得率達(dá)到33.28%。通過(guò)混合發(fā)酵法制備的水溶性膳食纖維溶脹度和持水力分別達(dá)到11.52 mL/g和7.32 g/g，符合高品質(zhì)膳食纖維的要求。

水溶性膳食纖維；混合發(fā)酵法；韭籽粕；得率

韭菜籽是韭菜干燥成熟的種子，又名韭菜子、韭子[1]。同時(shí)它也是傳統(tǒng)中藥的重要組分之一，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。文獻(xiàn)中記載其有“溫腎助陽(yáng)”的作用[2]，研究韭菜籽中生物活性成分的功能作用研究意義重大。

膳食纖維分為水溶性膳食纖維SDF和水不溶性膳食纖維IDF兩類(lèi)。水溶性膳食纖維主要是指不被人體消化道酶消化，但可溶于溫、熱水且其水溶液又能被其4倍體積的乙醇再沉淀的部分[3]。水溶性膳食纖維與水不溶性膳食纖維相比，具有特殊的生理活性，能在結(jié)腸中幾乎被徹底水解產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，因而對(duì)結(jié)腸癌的防治效果更好[4]，在清除機(jī)體的有害物質(zhì)和降低血清膽固醇等方面有效果較好[5]，因此水溶性膳食纖維在醫(yī)學(xué)界和食品界受到廣泛關(guān)注[6]。本文采用微生物混合發(fā)酵制備韭籽粕中水溶性膳食纖維，旨在獲取高品質(zhì)的水溶性膳食纖維，以其為韭菜籽的綜合利用等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

韭籽粕：平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠(chǎng)。

黑曲霉（40970）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；枯草芽孢桿菌：河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

FA1004B電子天平、PHSJ-3F型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDC-1044底速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；CXC-06粗纖維測(cè)定儀：上海新嘉電子有限公司；DL-1萬(wàn)用電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器：哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

韭籽粕→粉碎過(guò)篩→配制發(fā)酵培養(yǎng)基→121℃滅菌30 min→接入菌種→發(fā)酵→滅菌→離心分離→上清液→4倍體積乙醇醇沉→離心分離→干燥→SDF

1.2.2 韭籽粕的預(yù)處理

韭籽粕粉碎過(guò)60目篩，密封備用。

1.2.3 黑曲霉的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

參考練杰[7]方法，略有修改。配置CM0015察式瓊脂培養(yǎng)基，接種后于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d～7 d，然后繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2代～3代后恢復(fù)活力。然后，將恢復(fù)活力后的斜面培養(yǎng)的黑曲霉，加入生理鹽水制成106個(gè)/mL單胞子懸液，然后接種到100 mL不含瓊脂的察式種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3 d，待生成均一小菌絲球時(shí)用于發(fā)酵。取出置于4℃冰箱備用。

1.2.4 枯草芽孢桿菌的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌試管斜面進(jìn)行活化，接種于實(shí)驗(yàn)室常用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入生理鹽水制成106個(gè)/mL菌懸液，然后接種到100 mL不含瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)24 h后用于發(fā)酵。取出置于4℃冰箱備用。

1.2.5 混合發(fā)酵法制備韭籽粕水溶性膳食纖維單因素試驗(yàn)

影響黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵制備韭籽粕膳食纖維的主要因素有料液比、發(fā)酵時(shí)間、混合菌體積比例和接種量[4，8-9]。需要通過(guò)試驗(yàn)明確各個(gè)因素對(duì)提取效果的影響程度。發(fā)酵液初始pH值以及發(fā)酵溫度分別設(shè)置為7.0和30℃。

1.2.5.1 料液比對(duì)SDF得率的影響

稱(chēng)取韭籽粕3.0 g，發(fā)酵時(shí)間為48 h、接種量為10%、混合菌體積比例為 1∶3，分別選取 1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）為不同的料液比進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后加入4倍體積95%乙醇后靜置過(guò)夜，離心烘干沉淀計(jì)算SDF得率，從而確定最適料液比。

1.2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響

稱(chēng)取韭籽粕3.0 g，接種量為10%、混合菌體積比例為 1 ∶3、料液比為 1 ∶15（g/mL），分別選取 24、36、48、60、72 h為不同的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后加入4倍體積95%乙醇后靜置過(guò)夜，離心烘干沉淀計(jì)算SDF得率，從而確定最適發(fā)酵時(shí)間。

1.2.5.3 混合菌體積比例對(duì)SDF得率的影響

稱(chēng)取處理過(guò)的韭籽粕3.0 g，設(shè)定發(fā)酵液初始pH值為7.0、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h、接種量為10%、料液比為1∶20（g/mL），分別選取黑曲霉和枯草芽孢桿菌體積比為 1∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3∶1 為不同的混合菌比例進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后加入4倍體積95%乙醇后靜置過(guò)夜，離心烘干沉淀計(jì)算SDF得率，從而確定最適混合菌體積比例。

1.2.5.4 接種量對(duì)SDF得率的影響

稱(chēng)取處理過(guò)的韭籽粕3.0 g，發(fā)酵時(shí)間為24 h、料液比為 1 ∶20（g/mL）、混合菌體積比例為 1 ∶3，分別選取6%、8%、10%、12%、14%為不同的接種量進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后加入4倍體積95%乙醇后靜置過(guò)夜，離心烘干沉淀計(jì)算SDF得率，從而確定最適接種量。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分析各個(gè)因素對(duì)SDF含量的影響程度，確定正交試驗(yàn)各個(gè)因素水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1L9（34）factors and levels of orthogonal test

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交分析，確定各因素對(duì)SDF含量的影響程度的大小，從而得到最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3 SDF理化特性的測(cè)定[10-11]

1.3.1 膨脹力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g制得的SDF樣品于25 mL量筒中，記錄質(zhì)量m（g）和體積V1（mL），準(zhǔn)確加入蒸餾水10 mL，用磁力攪拌器使SDF分散均勻，置于25℃的水浴鍋恒溫，在第24小時(shí)記錄充分溶脹后的物料的體積V2（mL），獲得最終溶脹度。膨脹力=（V2-V1）/m。

1.3.2 持水力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取制得的SDF樣品1.000g（m0）置于100mL燒杯中，加蒸餾水40 mL，磁力攪拌器使SDF溶液分散均勻，24 h后，轉(zhuǎn)移至離心管中，在3 500 r/min的速度下離心30 min，傾去上清液，擦干管壁附著的水分，稱(chēng)其質(zhì)量m1（g），并計(jì)算出每克SDF樣品的持水力（WCH）。WCH/（g/g）=（m1-m0）/m0。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭籽可溶性膳食纖維提取條件的確定

2.1.1 料液比的確定

料液比對(duì)SDF得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)SDF得率的影響Fig.1 Effects of ratios of material and liquid on the yield of SDF

由圖1可知，隨著料液比的增加，SDF的得率呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，SDF得率達(dá)到最大。之后韭籽SDF得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。發(fā)酵液中水分過(guò)多或者過(guò)少都不利于枯草芽孢桿菌和黑曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，從而影響到SDF的得率[10]。因此，選擇1∶15（g/mL）為最佳料液比。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，最初SDF得率呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在60 h時(shí)SDF得率達(dá)到最大為27.04%。而后則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，其可能原因是發(fā)酵開(kāi)始時(shí)菌體自身生長(zhǎng)，SDF也不斷積累，60 h達(dá)到最大，然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)酵液pH值發(fā)生變化，抑制了自身菌體的生長(zhǎng)，從而使發(fā)酵產(chǎn)生的可溶性膳食纖維量減少[12]。結(jié)合實(shí)際情況考慮，選擇60 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.1.3 混合菌體積比例的確定

混合菌體積比例對(duì)SDF得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SDF得率的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the yield of SDF

圖3 混合菌體積比例對(duì)SDF的影響Fig.3 Effects of the proportion of mixed bacteria on yield of SDF

由圖3可知，隨著混合菌體積比例的變化，SD得率出現(xiàn)先增長(zhǎng)在降低的趨勢(shì)。隨著黑曲霉比例的降低，SDF含量出現(xiàn)增長(zhǎng)，在混合菌體積比為1∶1時(shí)，SDF得率最高為30.74%。其可能原因是當(dāng)兩種菌的體積比為1∶1時(shí)，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)恰好適合兩種菌的生長(zhǎng)，所以SDF得率較高；而當(dāng)為其它接種比例時(shí)，兩種菌之間可能存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因而發(fā)酵效果較差[12]。因此，選擇混合菌體積比例1∶1為最佳比例。

2.1.4 接種量的確定

接種量對(duì)SDF得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 接種量對(duì)SDF得率的影響Fig.4 Effects of the inoculum on the yield of SDF

由圖4可知，隨著接種量的增多，SDF得率先升高，在接種量為8%時(shí)，SDF得率最高達(dá)到30.24%。之后，隨著接種量的增加，SDF得率逐漸下降。其可能原因是在有限的營(yíng)養(yǎng)中，隨著接種量的增大，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不上菌體的生長(zhǎng)，即接種量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致前期發(fā)酵劇烈，后期發(fā)酵不足，因而SDF得率降低[4]。因此，8%接種量比較合適。

2.2 韭籽粕水溶性膳食纖維提取條件優(yōu)化

四因素三水平正交表試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of L9（34）orthogonal test

由表2可以看出，韭籽水溶性膳食纖維SDF的最佳發(fā)酵工藝條件為 A3B3C1D3，即料液比為 1∶20（g/mL），發(fā)酵時(shí)間為72 h，混合菌比例為2∶1，接種量為10%。由極差分析可知，各因素作用的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即發(fā)酵時(shí)間＞料液比＞混合菌體積比例＞接種量。方差分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal combination experiment

由方差分析表3可以看出，F(xiàn)A=103.274＞F0.01（2，4）=99，F(xiàn)B=205.720＞F0.01（2，4）=99，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間和料液比對(duì)水溶性膳食纖維SDF得率影響差異極顯著，即發(fā)酵時(shí)間和料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著。FC=24＞F0.05=19，認(rèn)為因素C即混合菌體積比例對(duì)水溶性膳食纖維SDF得率影響差異顯著。而FD=1.000＜F0.05=19，認(rèn)為因素D對(duì)水溶性膳食纖維SDF得率無(wú)顯著影響。從各個(gè)因素的F值大小可看出，各因素對(duì)SDF的得率影響的主次順序：發(fā)酵時(shí)間＞料液比＞混合菌體積比例＞接種量，最優(yōu)水平組合為A3B3C1D3，這與用極差的判斷結(jié)果一致。由于表3中沒(méi)有A3B3C1D3，因此需要對(duì)得到的最佳水平進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此最佳工藝條件下SDF得率達(dá)到33.28%，均優(yōu)于正交表中所有組合，確定其為最佳的發(fā)酵條件，即料液比為1∶20（g/mL），發(fā)酵時(shí)間為 72 h，混合菌體積比例為 2∶1，接種量為10%。

2.3 韭籽SDF理化特性測(cè)定

2.3.1 膨脹力的測(cè)定結(jié)果

膨脹力/吸水性是指產(chǎn)品吸附或攝取水分的能力。通常用每克產(chǎn)品吸附水分的克數(shù)或毫升數(shù)來(lái)表示。本試驗(yàn)測(cè)得的SDF的膨脹力為11.52 mL/g。

2.3.2 持水力的測(cè)定

由試驗(yàn)可得持水力7.32 g/g，韭籽SDF的持水力比較高。

3 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，混合發(fā)酵法制備韭籽粕水溶性膳食纖維SDF的最佳發(fā)酵工藝為：料液比為1∶20（g/mL），發(fā)酵時(shí)間為72 h，混合菌體積比例為2∶1，接種量為10%。在此工藝條件下，水溶性膳食纖維得率達(dá)到33.28%。高品質(zhì)膳食纖維它的溶脹性應(yīng)大于10 mL/g，持水力不小于7 g/g[13]，而本試驗(yàn)制備的水溶性膳食纖維溶脹度和持水力分別達(dá)到11.52 mL/g、7.32 g/g，符合高品質(zhì)膳食纖維的要求。這為推動(dòng)韭菜籽資源的充分利用，開(kāi)發(fā)新型水溶性膳食纖維產(chǎn)品提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Preparation of Soluble Dietary Fiber from Chinese Leek Seed Meal by Mixed Fermentation

SUN Jie1，YIN Guo-you1，WANG Chao2，WANG Qi3，LI Wen-jian1，ZHANG Xian-qing1
（1.College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，Henan，China；2.College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，Zhejiang，China；3.Guelph Food Research Centre，Agriculture and Agri-Food Canada，Guelph N1G5C9，Ontario，Canada）

In this study，we studied the preparation of soluble dietary fiber from Chinese leek seed meal by mix-fermentation and investigated the effects of ratios of material and liquid，fermentation time，the proportion of mixed bacteria and inoculum on yield of SDF by single factor.Then the extraction technology was optimized by L9（34）orthogonal test to determine the best process conditions.The optimal extraction process was found as follows：ratios of material and liquid is 1 ∶20（g/mL），fermentation time was 72 hours，the proportion of mixed bacteria was 2∶1 and the inoculum was 10%，the yield of soluble dietary fiber was 33.28%.Moreover，the degree of swelling of soluble dietary fiber preparation and holding capacity reached 11.52 mL/g and 7.32 g/g separately，in line with the requirements of high-quality dietary fiber.

soluble dietary fiber；mix fermentation；Chinese leek seed meal；yield

2016-08-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.021

河南省科技計(jì)劃重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（132102210192；152102210091）；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（152107000052）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（17A550008）

孫婕（1976—），女（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化及功能性質(zhì)研究。