曹昱，李志剛

（1.廣州植之元油脂實業(yè)有限公司，廣東廣州511462；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640）

天然與發(fā)酵蟲草菌絲體中多糖組份及活性比較

曹昱1，李志剛2

（1.廣州植之元油脂實業(yè)有限公司，廣東廣州511462；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640）

為找出發(fā)酵蟲草菌絲體與天然蟲草菌絲體的差異，對其多糖成分、含量進(jìn)行比較研究，并利用細(xì)胞增殖實驗對生物活性進(jìn)行分析比較。發(fā)酵蟲草存在兩種多糖，分子量分別為3 682 kDa和166 kDa；天然蟲草多糖存在3種多糖，分子量分別為400 kDa，215 kDa和127 kDa。細(xì)胞活性實驗表明，發(fā)酵蟲草多糖和天然蟲草多糖均對脾細(xì)胞增殖的具有促進(jìn)作用，且發(fā)酵蟲草多糖對脾細(xì)胞增殖促進(jìn)作用稍優(yōu)于天然蟲草多糖。兩種多糖均可降低腫瘤上清液對小鼠脾細(xì)胞的體外增殖的抑制作用，兩者無顯著性差異；加入蟲草多糖的各種腫瘤上清液的TGFβ1的分泌量明顯降低，兩種蟲草多糖都能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖，但無顯著性差異。說明兩種多糖的生物活性沒有明顯差異。

冬蟲夏草；蝙蝠蛾擬青霉；多糖；發(fā)酵；生物活性

冬蟲夏草具有極其重要的食用和藥用價值。隨著市場需求日益增大，造就國內(nèi)外市場貨源緊缺且價格高昂，蟲草的人工栽培就成為研究熱點。為此研究人員從西藏那曲產(chǎn)地的新鮮冬蟲夏草菌（Cordyccps sincnsis（Berk.）Sacc.）中分離出了多個菌株，有研究發(fā)現(xiàn)其中蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces Hepiali Chen&Dai）菌株與冬蟲夏草的親緣關(guān)系基本相似[1-2]。衛(wèi)生部于2001年批準(zhǔn)了兩種冬蟲夏草菌絲體用于保健食品，其中之一就為蝙蝠蛾擬青霉。利用其進(jìn)行液體深層發(fā)酵制取的產(chǎn)品已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化和商業(yè)化產(chǎn)品[3]。目前，以蝙蝠蛾擬青霉為菌株的液體發(fā)酵已有大量研究，從其發(fā)酵液中分離得到的多糖類物質(zhì)具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保護(hù)肝臟等多種生物活性[4-6]。但發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖含量及活性同天然冬蟲夏草的對比鮮見研究報道。本研究利用從蝙蝠蛾擬青霉的深層液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖活性物質(zhì)，同天然蟲草多糖進(jìn)行比較，考察有效成分的差異，對脾細(xì)胞增殖的影響，對人體癌細(xì)胞的抑制作用差異，同時考察兩種來源的多糖組分對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響及對人體肺癌細(xì)胞的抑制效果的差異，最后通過考察他們對免疫抑制因子TGFβ1分泌量的影響來確定對腫瘤細(xì)胞的抑制作用差異。通過此研究對比可對以蝙蝠蛾擬青霉深層發(fā)酵為基礎(chǔ)的產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗蟲草菌

天然蟲草：無限極（中國）有限公司。

蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyces hepiali：中國科學(xué)院廣東省微生物研究所。

發(fā)酵蟲草菌絲體：蝙蝠蛾擬青霉利用經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基經(jīng)5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵制得，其溫度為25℃，接種量為10%，發(fā)酵pH為4、發(fā)酵形成的菌絲體經(jīng)10 000 r/min，4℃下離心10 min后，置于60℃烘箱中24 h至烘干，即制得發(fā)酵蟲草菌絲體[7]。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞株和試驗動物

4周齡～6周齡昆明小鼠，雌雄各半，18 g～22 g：廣東省實驗動物中心。

A549細(xì)胞株（人肺癌細(xì)胞株）：中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.3 藥材與試劑

25 cm2培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔板：康寧公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶：Gibco公司；30%H2O2、5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，a tetrazole，MTT）、異丁醇、SDS、鹽酸等：廣州化學(xué)試劑廠；有絲分裂源脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，Cat.no：S1732）：碧云天生物技術(shù)研究所；TGFβ1（m）ELISA kit（小鼠的轉(zhuǎn)化生長因子β1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，Cat.no：EK0515）、ELISA 用活化劑（Cat.no：AR1102）：武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4 主要試驗儀器

真空干燥箱DZF-6020型：上海申賢恒溫設(shè)備廠；酶標(biāo)儀Anthos Zenyth 200rt：北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；Centrifuge5810R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；高效液相色譜儀：美國Waters公司；HLPHA-1-4真空凍干機(jī)：德國Christ公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Themro公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體胞內(nèi)多糖含量測定

將干燥后天然蟲草和發(fā)酵菌絲體研磨成粉末，精確稱取1 g蟲草粉或發(fā)酵菌絲體，加入20 mL超純水，置于50 mL具塞三角瓶中，混勻后，放置在磁力加熱器上，90℃甘油浴3 h，取出冷卻后，定容至50 mL。5 000 r/min，離心10 min，分離菌體與提取液，取上清液1 mL，加入4 mL無水乙醇至醇濃度為80%，4℃條件下放置12 h后，3 000 r/min，離心5 min，沉淀用80%乙醇洗滌兩次。沉淀為蟲草粗多糖，按照水提-醇沉法提取多糖，采用苯酚硫酸法測定多糖含量[8]。

1.2.2 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體腺苷含量的檢測

按水提-醇沉法超聲破碎細(xì)胞并收集上清液，利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測腺苷含量[9]。

1.2.3 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體中多糖的精制

將按照1.2.1的方法制得的粗多糖，用Sevage法去蛋白，并利用分子量為3 000的透析膜透析48 h，透析液經(jīng)乙醇沉淀12 h，再經(jīng)無水乙醇洗滌，冷凍干燥，得到蟲草精多糖。

1.2.4 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體多糖成分的測定

天然蟲草和發(fā)酵菌絲體多糖成分測定采用高效凝膠滲透色譜法。色譜條件：TSK-GEL G-5000PWXL column（7.8 mm×300 mm）與 TSK-GEL G-3000PWXL column（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)；流動相0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH6.0；流速 0.6 mL/min；柱溫 35℃；檢測器：示差檢測器。

1.2.5 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體中多糖生物活性的測定

1.2.5.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備

小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡3 min，取出小鼠置于無菌皿上，在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，取出紅色長條狀脾臟；放入盛有5 mL Hanks液的培養(yǎng)皿中稍洗滌；將脾臟放置于200目不銹鋼網(wǎng)上，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察脾細(xì)胞，進(jìn)行計數(shù)，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞。

1.2.5.2 蟲草多糖對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響

調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×108/L，在96孔板中每孔加入100 μL脾細(xì)胞懸液，實驗組每孔加入不同濃度的蟲草多糖待測樣100 μL和10 μg/mL的LPS，轉(zhuǎn)化對照組加入10 μg/mL的LPS，每組均設(shè)6個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，向?qū)嶒灲M和對照組每孔加入終濃度為0.5%的MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，培養(yǎng)時間結(jié)束，每孔加入150 μL MTT三聯(lián)溶解液（10%SDS、5%異丁醇、0.012 mmol/L HCl），置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度（OD值）[10]。

1.2.5.3 分析蟲草多糖對A549細(xì)胞增殖情況的影響

調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107/L，在96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，實驗組每孔加入不同濃度的蟲草多糖待測樣100 μL，空白對照組加入等量的完全培養(yǎng)基，每組均設(shè)6個復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，向?qū)嶒灲M和對照組每孔加入終濃度為0.5%的MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，培養(yǎng)時間結(jié)束，每孔加入150 μL MTT三聯(lián)溶解液（10%SDS、5%異丁醇、0.012 mmol/L HCl），置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度（OD值）[11]。

1.2.5.4 各種腫瘤上清液的制備

調(diào)整A549細(xì)胞濃度為5×108/L接種于6孔板，各種條件分別培養(yǎng)A549細(xì)胞一定時間后，收集以下腫瘤上清液：單純腫瘤上清液（M0）、含最適天然蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的上清液（M1）、含最適天然蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h的上清液（M2）、含最適天然蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)液，加入新的不含蟲草多糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h的上清液（M3）；含最適發(fā)酵蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的上清液（N1）、含最適發(fā)酵蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h的上清液（N2）、含最適發(fā)酵蟲草多糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)液，加入新的不含蟲草多糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h的上清液（N3）。

1.2.5.5 各種腫瘤上清液對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響

調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×108/L，在96孔板中每孔加入100 μL脾細(xì)胞懸液，實驗組每孔加入各種腫瘤上清液100 μL 和 10 μg/mL 的 LPS，轉(zhuǎn)化對照組加入 10 μg/mL的LPS，每組均設(shè)3個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，向?qū)嶒灲M和對照組每孔加入終濃度為0.5%的MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，培養(yǎng)時間結(jié)束，每孔加入150 μL MTT三聯(lián)溶解液（10% 十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，sodium salt，SDS）、5% 異丁醇、0.012 mmol/L HCl），置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度（OD值）。

1.2.5.6 ELISA法測定各種腫瘤上清液中TGFβ1的分泌量

ELISA法測定M0-M3、N1-N3腫瘤上清液TGFβ1的含量，按照試劑盒說明書操作，每組設(shè)3個復(fù)孔。根據(jù)樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出其對應(yīng)的濃度（pg/mL）。

準(zhǔn)備工作：配制 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，將腫瘤上清液進(jìn)行TGFβ1活化，按照100 μL樣品中加活化劑20 μL A液，10 min后再加20 μL B液。

操作步驟：1.確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目，并增加1孔作為空白顯色孔。2.將1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 mL依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液作為零孔。加入各組已活化的腫瘤上清液各100 μL，每組做3個重復(fù)。3.酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90 min。4.反應(yīng)后甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下，不洗。5.將準(zhǔn)備好的生物素抗小鼠TGFβ1抗體工作液按每孔0.1 mL依次加入（空白顯色孔除外），37℃反應(yīng)60 min。6.0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次浸泡1 min左右。7.將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入（空白顯色孔除外），37℃反應(yīng)30 min。8.0.01 mol/L PBS 洗滌 5 次，每次浸泡 1 min～2 min。9.按每孔 90 μL依次加入四甲基聯(lián)苯胺（4，4'-Bi-2，6-xylidine；4，4'-Diamino-3，3'，5，5'-tetramethylbiphenyl，TMB）顯色液，37℃避光反應(yīng)25 min～30 min。10.按每次0.1 ml依次加入TMB終止液，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。11.用酶標(biāo)板在450 nm測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體有效成分的比較

天然蟲草、發(fā)酵菌絲體主要成分見表1。

與天然蟲草多糖試驗的對照表明，發(fā)酵蟲草存在兩種多糖，分子量為3 682 kDa和166 kDa；天然蟲草多糖存在3種多糖，分子量分別為400、215、127 kDa，均在150 kDa～200 kDa區(qū)段存在活性多糖。經(jīng)過優(yōu)化的發(fā)酵蟲草中主要的有效活性成分比天然蟲草具有明顯的提升，其中菌絲體中多糖和腺苷含量比天然蟲草增加了2倍和6倍。但和天然蟲草相比，發(fā)酵蟲草的種類比天然蟲草少，而且其分子量大小和含量也有較大的差異，可以發(fā)現(xiàn)天然蟲草多糖與發(fā)酵菌絲體多糖的含量和成分差異較大。

表1 天然蟲草和發(fā)酵菌絲體的主要成分Table 1 The composition of natural cordyceps polysaccharides and the fermentation

2.2 蟲草多糖對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響

脾是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官，內(nèi)含大量的免疫細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞約占40%，B淋巴細(xì)胞約占60%，在體液免疫中的地位極其重要。因此，研究蟲草多糖有效成分對機(jī)體免疫器官的作用是研究免疫調(diào)節(jié)作用的一個重要方面。天然蟲草多糖、發(fā)酵菌絲體多糖對小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響情況見表2。

表2 蟲草多糖對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響Table 2 Effects of LPS induced mice spleen cells proliferation by cordyceps polysaccharides in vitro

與空白組相比較，天然蟲草多糖在10、50、100、200 μg/mL時對LPS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的小鼠脾細(xì)胞的增殖無明顯作用，150 μg/mL時有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖的作用。發(fā)酵蟲草多糖在10、50、200 μg/mL時對LPS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的小鼠脾細(xì)胞的增殖無明顯作用，100、150 μg/mL時有促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖的作用。且發(fā)酵蟲草多糖對脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用稍優(yōu)于天然蟲草多糖。

2.3 蟲草多糖對A549細(xì)胞增殖情況的影響

蟲草多糖對A549細(xì)胞增殖情況的影響見表3。

與空白組相比較，隨著蟲草多糖濃度的增大，A549細(xì)胞的抑制率也呈線性增加。其中，當(dāng)天然蟲草多糖、發(fā)酵蟲草多糖的濃度大于100 μg/mL時，與空白組相比較，對A549細(xì)胞具有明顯抑制作用。

表3 蟲草多糖對A549細(xì)胞體外增殖的影響Table 3 Effects of A549 cells proliferation by cordyceps polysaccharides in vitro

由于濃度為100 μg/mL的蟲草多糖對A549的細(xì)胞抑制作用不明顯（P＞0.05），對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的體外增殖具有促進(jìn)作用。本試驗選取既對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的體外增殖具有促進(jìn)作用，同時又對A549細(xì)胞無明顯毒副作用的濃度作為試驗濃度，即100 μg/mL的蟲草多糖。

2.4 腫瘤上清液對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響

腫瘤上清液對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響見表4。

表4 各種腫瘤上清液對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響Table 4 Effects of LPS induced mice spleen cells proliferation by various tumor supernatants in vitro

與空白組（不加腫瘤上清液）相比較，單純的腫瘤上清液M0組明顯抑制了小鼠脾細(xì)胞的體外增殖，其細(xì)胞存活量只有對照組的一半左右。而加入蟲草多糖的各種腫瘤上清液能降低這種抑制作用，與對照組相比較沒有明顯差異（P＞0.05）。天然蟲草多糖與發(fā)酵蟲草多糖相比較，二者對小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響沒有明顯差異。

2.5 ELISA法測定各種腫瘤上清液中TGFβ1的分泌量

TGFβ1是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)因子，對不同的細(xì)胞具有不同的作用。通過各腫瘤上清液中的TGFβ1含量可以判斷蟲草多糖對腫瘤細(xì)胞生長增殖的抑制作用[12]。各種腫瘤上清液中TGFβ1的分泌量見表5。

表5 各種腫瘤上清液中TGFβ1的分泌量Table 5 Secretion of TGFβ1 in various tumor supernatant fluid

與單純腫瘤上清液M0組相比較，加入蟲草多糖的各種腫瘤上清液的TGFβ1的分泌量明顯降低（P＜0.05），說明蟲草多糖對腫瘤上清液中的免疫抑制因子有抑制作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖。但M1、M2、M3，N1、N2、N3 各組之間沒有明顯差異。推測天然蟲草多糖和發(fā)酵蟲草多糖對腫瘤細(xì)胞的抑制在作用24 h就可顯現(xiàn)，并且最少可維持48 h，但兩種多糖的這種抑制作用沒有顯著性差異。

3 結(jié)論

與然蟲草多糖與發(fā)酵蟲草多糖在組成和含量上都有較大差異，但通過細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)兩種多糖組份均對脾細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，且發(fā)酵蟲草多糖對脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用稍優(yōu)于天然蟲草多糖；兩種蟲草多糖對人肺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用，且沒有顯著性差異。兩種多糖均可降低腫瘤上清液對小鼠脾細(xì)胞的體外增殖的抑制作用，進(jìn)一步的實驗表明，加入蟲草多糖的各種腫瘤上清液的TGFβ1的分泌量明顯降低，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種多糖組分的生物活性沒有顯著性差異。

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Comparison of Polysaccharide Components and Functional Activities of Fermentation and Natural Paecilomyces hepialid

CAO Yu1，LI Zhi-gang2
（1.Guangzhou Green Oil Industrial Co.，Ltd.，Guangzhou 511462，Guangdong，China；2.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

In order to find out the differences between the fermentation mycelium and the natural mycelium of Paecilomyces hepialid，a comparative study on the composition and content of polysaccharide were analyzed.And the bioactivities of polysaccharides from two kinds of mycelium were compared by MTT assay.There were two polysaccharides in fermentation mycelium，molecular weight of 3 682 000 and 166 000.And there were three polysaccharides in natural mycelium，molecular weight of 400 000，215 000 and 127 000.The MTT assay showed that both kinds of polysaccharides had promoting effect to the spleen cell proliferation，and the fermentation polysaccharides were slightly better.Both kinds of polysaccharides could reduce the inhibition of tumor supernatant of murine spleen cell proliferation in vitro，and there was no significant difference between two kinds of polysaccharides.The secretion of TGFβ1 of various tumors supernatant，which added polysaccharides，was significantly reduced.Both kinds of could inhibit the growth of tumor cells，and there was no significant difference between two kinds of polysaccharides.It showed that there were no significant differences between two kinds of polysaccharides in biological activities.

Cordyceps sinensis；Paecilomyces hepialid；polysaccharides；fermentation；biological activities

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.006

曹昱（1984—），男（漢），工程師，博士，主要從事食品工程研究。