王銳

（昭通學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通657000）

余甘子多酚α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化作用

王銳

（昭通學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通657000）

采用α-葡萄糖苷酶抑制模型，研究余甘子多酚提取物（polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.，PEPs）對α-葡萄糖苷酶抑制作用，并通過PEPs還原能力及自由基清除試驗，測定其抗氧化作用。結(jié)果表明，PEPs能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率可達95.71%，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.71 mg/mL。PEPs具有一定的還原能力，在0.01 mg/mL～0.03 mg/mL，PEPs的還原能力與維生素C（Vitamin C，VC）相當(dāng)。PEPs能有效清除自由基，其清除羥基自由基（·OH）和 1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）的 IC50值分別為 0.77 mg/mL、5.23 mg/L，清除 DPPH·的能力高于 VC，且PEPs對α-葡萄糖苷酶的抑制及抗氧化作用呈劑量依賴關(guān)系，PEPs具有很好的開發(fā)價值。

余甘子；多酚；α-葡萄糖苷酶；抑制；抗氧化

余甘子（Phyllanthus emblica L.）為大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實，主產(chǎn)于熱帶、亞熱帶的印度、斯里蘭卡、馬來西亞及我國云南、貴州、福建、廣西、廣東等地。余甘子性味甘、酸、澀、可清熱涼血、消食健胃、生津止咳，自古以來在民間就作為健身和藥用水果，被列入既是食品又是藥品的名單。余甘子含有豐富的超氧化物歧化酶、維生素、黃酮、皂苷、多糖及多酚等活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制病毒、增強免疫力等功效[1-3]。余甘子作為藥食同源植物，具有較高的食療保健價值，已開發(fā)出了余甘子酒、罐頭、飲料等功能性食品及余甘子口服液、凍干粉等保健產(chǎn)品。在對余甘子營養(yǎng)成分和保健作用的深入研究中發(fā)現(xiàn)，余甘子可明顯改善胰島素抵抗，增強機體對胰島素的敏感性，顯著降低血糖[4-7]。隨著人們生活水平提高，糖尿病患者逐漸增多，尋找有效的糖尿病治療藥物和保健品成為人們研究的熱點。多酚是余甘子的主要功能性成分，目前鮮見余甘子多酚降血糖研究報道[1，8]。本實驗用α-葡萄糖苷酶抑制模型，研究余甘子多酚提取物的降血糖作用；由于抗氧化劑能減緩糖尿病患者氧化應(yīng)激，有助改善糖尿病患者糖代謝，有效預(yù)防糖尿病并發(fā)癥[9-10]，試驗同時對余甘子多酚提取物進行了體外抗氧化研究，以期為余甘子開發(fā)為糖尿病治療藥物或保健產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

余甘子鮮果于當(dāng)年11月中旬購自云南省昭通市；沒食子酸對照品：中國藥品生物制品檢定所；福林酚（Folin-Ciocalteu，F(xiàn)C）：南京奧多福尼生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、阿卡波糖、1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）：美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZKF035真空干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；XFB-200家用粉碎機：吉首巿中湘制藥機械廠；PHS-25數(shù)顯pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK5200LHC超聲波洗滌器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-S601超級恒溫水浴鍋：金壇市岸頭良友實驗儀器廠；UV/VIS2802PCS紫外-可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司。

2 方法

2.1 余甘子多酚提取物的制備

將新鮮余甘子清洗去核，70℃烘干粉碎，過60目篩。加入10倍體積石油醚，超聲波（35 kHZ，250 W）浸提15 min，除去其中的脂類、色素等成分，抽濾、晾干回收粉末。粉末按料液比1∶20，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，超聲波（53 kHZ，250 W）浸提 30 min，過濾，濾液減壓濃縮、定容，得余甘子多酚提取物（polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.，PEPs），置于 4 ℃冰箱保藏備用[11]。

2.2 PEPs總酚含量的測定

采用福林酚（FC）比色法測定余甘子總酚含量[12]。分別精確量取0.143 2 mg/mL沒食子酸溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 比色管中，補充去離子水至5 mL，加入1.5 mL，1 mol/L FC試劑，搖勻，放置2 min。然后，加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%碳酸鈉溶液，加去離子水定容至25 mL，搖勻，置于30℃水浴加熱30 min，取出冷至室溫，以第一管為空白對照，于765 nm波長處測吸光度值，平行測3次，取平均值，用origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同法測定余甘子中所提多酚的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，按公式計算出樣品中總酚含量。

式中：C為線性方程計算出的質(zhì)量濃度，（mg/mL）；m為樣品質(zhì)量，g；V1為提取物定容體積，mL；V2為測定時反應(yīng)體系總體積，mL；V3為吸取測定體積，mL。

2.3 PEPs對α-葡萄糖苷酶抑制作用的測定

取0.5mLα-葡萄糖苷酶溶液（1mg/mL）與一定量的待測樣品溶液，補充pH 6.8磷酸鈉緩沖液（50 mmol/L）至混合溶液體積為3.5 mL，混勻，37℃孵育10 min，加入4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液0.5 mL（20 mmol/L），于37℃恒溫反應(yīng)30 min后，加入1 mL碳酸鈉溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)，室溫下平衡10 min，于405 nm波長處測定吸光度值。以阿卡波糖為陽性對照，試驗平行測定3次，求平均值，按下列公式計算抑制率[13]。用origin軟件繪制抑制曲線圖，求出相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

式中：ODa為空白對照溶液的吸光度值；ODb為空白對照溶液的本底吸光度值；ODe為加入樣品后溶液的吸光度值；ODf為樣品溶液的本底吸光度值。

2.4 PEPs抗氧化作用的測定

采用普魯士藍法、羥基自由基（·OH）清除法和1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）清除法測定PEPs的抗氧化能力，并以維生素C（Vitamin C，VC）做陽性對照進行比較。

2.4.1 還原能力測定

參考劉以娟等[14]的方法，在2.5 mL，pH 6.6磷酸鈉緩沖溶液（0.2 mol/L）中加入2.5 mL待測樣品溶液及2.5 mL質(zhì)量濃度1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃恒溫反應(yīng)20 min后，加入2.5 mL質(zhì)量濃度1%三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取2.5 mL上清液，在其中加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質(zhì)量濃度0.1%三氯化鐵溶液，混勻室溫反應(yīng)10 min，于700 nm波長處測吸光度值。試驗平行測定3次，取平均值，并用origin軟件繪制吸光度值圖。

2.4.2·OH清除能力測定

在試管中分別加入待測溶液，水楊酸溶液（9 mmol/L），硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）各 2 mL，最后加入過氧化氫溶液（8.8 mmol/L）2 mL，啟動反應(yīng)，37℃恒溫反應(yīng)30 min后，取出冷至室溫，在510 nm波長處測定混合溶液的吸光度值，平行測定3次，取平均值，依據(jù)下列公式計算自由基清除率[15]。通過origin軟件繪制抑制曲線圖，求出IC50值。

式中：ODx為加入待測溶液后的吸光度值；ODxo為待測溶液的本底吸光度值；ODo為空白對照溶液的吸光度值。

2.4.3 DPPH·清除能力測定

取2mL樣品溶液與2mLDPPH·溶液（1×10-4mol/L），混合均勻，25℃恒溫反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測定其吸光度值ODx，平行測定3次，取平均值。同時，同法測定2 mL溶劑與2 mL DPPH·溶液的吸光度值ODo，2 mL樣品溶液與2 mL溶劑的吸光度值ODxo，代入自由基清除率公式，計算出樣品的DPPH·清除率[15]，并通過origin軟件繪制抑制曲線圖，求出相應(yīng)IC50值。

3 結(jié)果與分析

3.1 PEPs中總酚含量

以吸光度值（Y）對沒食子酸濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=0.049 1 X+0.004 7（R=0.999 6）。將同法測定樣品溶液的吸光度值代入回歸方程，通過總酚含量公式計算得到余甘子多酚提取物中總酚含量為403.64 mg/g，表明余甘子中含有豐富的多酚類化合物。

3.2 PEPs對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

通過α-葡萄糖苷酶抑制模型，測定不同濃度PEPs對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。

圖1 余甘子多酚提取物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PEPs and Acarbose on α-glucosidase

由圖1可知，PEPs對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，在試驗條件下，其IC50為0.71 mg/mL。IC50值越低，則抑制活性越強。相較于陽性對照阿卡波糖（IC50為0.04 mg/mL），PEPs抑制作用低于阿卡波糖。低濃度時，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶具有劑量依賴性抑制，當(dāng)濃度高于0.35 mg/mL，其抑制作用不再隨濃度增大而增強，抑制率幾乎維持在85%左右。而PEPs在0.25 mg/mL～1.5 mg/mL，抑酶效果隨著PEPs質(zhì)量濃度的增大而增強，當(dāng)PEPs為1.5 mg/mL時抑制率達到95.71%，若其濃度繼續(xù)增大幾乎可完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性。表明，PEPs對α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其濃度之間有明顯的量效關(guān)系，PEPs是一種理想的α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有一定降血糖作用。

3.3 PEPs的抗氧化作用

3.3.1 PEPs的還原能力

體系中的抗氧化劑將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，使其與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍，700 nm波長處有最大吸收，所測吸光度值越大，還原能力越強，表明樣品的抗氧化性能越強。以VC為陽性對照，測定了PEPs的還原能力，結(jié)果見圖2。

圖2 余甘子多酚提取物和維生素C的還原能力Fig.2 Reducing ability of PEPs and VC

由圖2可見，PEPs具有一定的還原能力，其還原能力隨著PEPs濃度的增大而增強，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。低濃度（0.01 mg/mL～0.03 mg/mL）時，PEPs的還原能力與VC相當(dāng)，但隨著濃度升高，PEPs的還原能力低于VC。

3.3.2 PEPs對·OH的清除作用

自由基的清除率越高表明提取物的抗氧化活性越強。PEPs對·OH的清除作用見圖3。

圖3 余甘子多酚提取物和VC對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of PEPs and VCon·OH

如圖3所示，PEPs對·OH具有一定的清除作用，且與濃度呈計量關(guān)系，當(dāng)PEPs濃度為2 mg/mL時，清除率為96.09%。與陽性對照VC相比，PEPs的IC50為0.77 mg/mL，高于 VC（IC50為 0.17 mg/mL），表明 PEPs清除·OH的能力低于VC。

3.3.3 PEPs對DPPH·的清除作用

以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，清除率（%）為縱坐標(biāo)，繪制自由基清除率曲線，如圖4所示。

圖4 余甘子多酚提取物和VC對DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of PEPs and VCon DPPH·

由圖4可以看出，PEPs對DPPH·具有很強的清除能力，在試驗濃度 3.75 mg/L～11.25 mg/L，PEPs劑量依賴性清除DPPH·，在11.25 mg/L時，清除率達到了98.22%。與陽性對照比較，PEPs清除DPPH·的IC50為5.23 mg/L，低于VC的IC50（6.14 mg/L），表明PEPs清除DPPH·的能力強于VC。

4 結(jié)論與討論

通過體外α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化實驗，表明PEPs能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率可達95.71%，IC50為0.71 mg/mL；PEPs具有一定的還原能力，PEPs能有效清除自由基，清除·OH和DPPH·的IC50值分別為0.77 mg/mL、5.23 mg/L。PEPs與陽性對照相比較，除對DPPH·的清除能力較強外，其余均弱于陽性對照，這或許與PEPs的純度有關(guān)。下一步將對PEPs進行分離、純化，并對主要活性組分的作用機制進行研究。

多酚是存在于植物中的一類化合物，它可增加胰島β細胞增殖，促進胰島素分泌，提高血清中胰島素含量；同時，多酚能清除體內(nèi)過多自由基，減少過氧化脂質(zhì)，從而有效降低血糖、控制糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用臨床的如阿卡波糖、伏格列波糖及米格列醇等降糖藥雖具有強烈的抑制作用，但通常對肝臟及胃腸道產(chǎn)生副作用。相較于人工合成藥，天然植物多酚作用溫和持久，副作用小[16]。余甘子作為藥食兩用植物，其急性毒性實驗表明無明顯毒副反應(yīng)，這為余甘子的開發(fā)利用提供了安全依據(jù)[17]。余甘子中富含多酚類化合物，多酚含量為403.64 mg/g。余甘子多酚提取物不僅對α-葡萄糖苷酶活性產(chǎn)生抑制作用，而且還有一定抗氧化能力，具有很好的抗糖尿病功能食品的開發(fā)價值。

[1] 劉延澤,李海霞,許利嘉,等.藥食兼用余甘子的現(xiàn)代研究概述及應(yīng)用前景分析[J].中草藥,2013,44(12):1700-1706

[2] 聶東,馬驍,田徽.余甘子果實化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究進展[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報,2012,31(11):61-66

[3] 王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥,2011,13(11):52-56

[4] 劉鳳書,侯開衛(wèi),李紹家.余甘子的保健價值及開發(fā)利用前景[J].自然資源學(xué)報,1993,8(4):299-307

[5] 董坤,李昌煒,曲卉,等.余甘子對胰島素抵抗大鼠骨骼肌PKB表達和GLUT4 mRNA表達的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(21):2352-2355

[6] 韓剛,原海忠,董月,等.余甘子提取物對糖尿病小鼠血糖的影響[J].食品科學(xué),2009,30(9):210-212

[7] 康文娟,張廣梅,趙協(xié)慧,等.不同溶劑余甘子提取物的降血糖作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(30):18545-18547

[8] 郭志英,黃玉香,王國權(quán).余甘子治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究進展[J].海峽藥學(xué),2014,26(12):1-4

[9] 王志新,徐高磊,王延芬,等.氧化應(yīng)激和抗氧化劑在糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中可能的作用[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2013,42(4):12-15

[10]金昕,陶楓,陸灝,等.中藥抗氧化在糖尿病中應(yīng)用研究進展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,26(4):110-114

[11]李永強,楊士花,岳曉川,等.野生滇橄欖多酚提取工藝的優(yōu)化[J].中國食物與營養(yǎng),2015,21(5):46-50

[12]王銳,師睿,熊汝琴,等.木蝴蝶不同極性組分體外抗氧化活性研究[J].昭通學(xué)院學(xué)報,2016,38(5):38-42

[13]肖小華,王麗華,徐麗瑛,等.梔子抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(8):210-214

[14]劉以娟,范方輝,王芳兵,等.葡萄籽提取物體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(18):143-148

[15]王銳,熊汝琴,羅家剛,等.木蝴蝶提取物對酪氨酸酶的抑制及抗氧化作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(18):70-72

[16]翟清波,李誠,王靜,等.植物多酚降血糖和降血脂作用研究進展[J].中國藥房,2012,23(3):279-282

[17]高鷹,李存仁.余甘子的抗炎作用與毒性的實驗研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,1996,17(2):47-50

Inhibition Effect on α-Glucosidase and Antioxidant Activity for Polyphenol Extracts from Phyllanthus emblica L.

WANG Rui
（College of Chemistry and Life Science，Zhaotong University，Zhaotong 657000，Yunnan，China）

The model of α-glucosidase inhibition was used to determine the inhibition effect of polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.（PEPs）on α-glucosidase.And the antioxidant activity of PEPs was also studied by reducing power and radical scavenging test.The results indicated that PEPs showed good inhibition activity on α-glucosidase，its maximum inhibition rate was up to 95.71%，and half inhibitory concentration（IC50）of PEPs was 0.71 mg/mL.PEPs had a certain reducing power，its reducing power was almost identical to Vitamin C（VC）in the concentration range of 0.01 mg/mL-0.03 mg/mL.PEPs had better scavenging effect on hy droxylfreeradical（·OH）and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical（DPPH·），theIC50were0.77mg/mL，5.23 mg/L respectively，and the scavenging effect on DPPH·was better than VC.Meanwhile PEPs showed dose dependent for the inhibition activity on α-glucosidase and antioxidant activity.So it has the very good development value.

Phyllanthusemblica L.；polyphenol；α-glucosidase；inhibition；antioxidant

2017-02-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.004

王銳（1976—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)研究。