陳秋娟，謝微，羅楊合

（1.賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899）

馬蹄皮提取液抗氧化的穩(wěn)定性研究

陳秋娟1，謝微2，*，羅楊合2

（1.賀州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899）

研究濃度、溫度、時(shí)間、pH值對馬蹄皮提取液的抗氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明濃度大于2.4 mg/mL時(shí)對馬蹄皮提取液的抗氧化性無影響，時(shí)間、溫度、pH值對它的抗氧化性影響較大。在37℃、1 h、pH值為5時(shí)得到最佳羥自由基清除率，且耐酸耐堿。馬蹄皮提取液的抗氧化穩(wěn)定性與抗壞血酸的穩(wěn)定性接近，可以代替抗壞血酸。

馬蹄皮；抗氧化；羥自由基

抗氧化劑它主要用于阻止或延緩油脂的自動(dòng)氧化，還可用于防止食品因氧而使?fàn)I養(yǎng)褐變、損壞、褪色等?？寡趸瘎V泛應(yīng)用于食品工業(yè)，而且需求量逐年增加，抗氧化劑分為人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。過去人工合成抗化劑以其高效、價(jià)錢便宜而大量應(yīng)用于食品制品中。但是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展來，人們崇尚天然物質(zhì)，天然抗氧化劑的開發(fā)利用開始流行起來。

馬蹄是荸薺的俗稱，馬蹄屬沙草科植物荸薺的球莖，原產(chǎn)于印度，在我國主要分布于江蘇、安徽、浙江、廣西等水澤地區(qū)。馬蹄具有很好的醫(yī)療保健效果，其苗秧、根、果實(shí)均可入藥。馬蹄的應(yīng)用很廣泛，像用來做馬蹄罐頭、馬蹄糕、果醋等，在加工馬蹄的過程中馬蹄皮總是被拿來做廉價(jià)的豬飼料或是直接丟棄，這樣就造成了浪費(fèi)。

對于馬蹄皮已經(jīng)有許多科研工作者進(jìn)行了大量的研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，色素[1]、黃酮[2]、酚類[3]等都是馬蹄皮提取液的重要組成部分。酚類一般都具有抗氧化性質(zhì)，大量的試驗(yàn)也表明馬蹄皮提取液具有抗氧化性[4]，具有抗氧化性就有被用作抗氧化劑的發(fā)展前景，但是要大量使用就必須知道它的抗氧化的穩(wěn)定性，根據(jù)實(shí)際來確定使用范圍。穩(wěn)定性越好，發(fā)展的空間越大就可以為天然抗氧化劑的發(fā)展出一份力。

能夠體現(xiàn)物質(zhì)的抗氧化性的體系有很多，比如：清除DPPH體系[5-6]、H2O2體系[7-8]、清除亞硝酸離子體系[9-10]、清除羥自由基體系[11-12]、測定油脂的過氧化值[13]。

本文選用清除羥自由基體系來體現(xiàn)馬蹄皮提取液的抗氧化性，從時(shí)間、濃度、溫度、pH值4個(gè)方面因素來研究馬蹄皮提取液的抗氧化穩(wěn)定性，旨在得出馬蹄皮提取液的穩(wěn)定性的相關(guān)數(shù)據(jù)，為日后科研工作者做相關(guān)的數(shù)據(jù)支持，提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬蹄皮：購于賀州鵝塘馬蹄收購點(diǎn)。

無水乙醇：天津市鼎盛鑫化工有限公司；六水合硫酸亞鐵銨：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙酸、雙氧水、濃鹽酸、氫氧化鈉：西隴化工股份有限公司；醋酸鈉：廣州化學(xué)試劑廠；抗壞血酸：杭州新方五交化有限公司；鄰二氮菲：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司（以上藥品均為分析純）；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；722-E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀有限公司制造；JA2103N型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HHS-21-6型電子恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)：河北省黃驊市新興電器廠；SHZ型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 馬蹄皮樣液的制取

馬蹄皮，清水洗干凈，置于通風(fēng)處自然風(fēng)干。用微型植物粉碎機(jī)粉碎，收集粉末。稱取5g馬蹄皮粉末，用50%乙醇溶液以1∶20（g/mL）的料液比在35℃恒溫下提取2 h，過濾，濾渣再用50%的乙醇溶液進(jìn)行1 h的二次提取，過濾，合并濾液，用蒸餾水定容至250 mL。得到樣液，放置在4℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.2 清除羥自由基的測定

采用Fenton反應(yīng)法[14-15]。Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：H2O2+Fe2+=·OH+OH-+Fe3+，F(xiàn)e2+-鄰二氮菲反應(yīng)，生成紅色配合物，該化合物在510 nm處有最大吸收。加入雙氧水后，體系的吸光度會變小，這時(shí)如果加入具有抗氧化性的物質(zhì)，可以減弱雙氧水對Fe2+和鄰二氮菲體系的氧化作用，從而減小體系吸光度的變化。

取 6 支 25mL 比色管，編號為 1、2、3、4、5、6，在 1、2、3、4加入一定量的0.01 mol/L的硫酸亞鐵銨溶液和一定量的0.01 mol/L的鄰二氮菲溶液，在1、2、5號比色管中加入一定量的馬蹄皮樣液，在1、3號比色管中加入一定量的0.06%的雙氧水，6支比色管均用蒸餾水定容至刻度。把6支比色管在一定恒溫下反應(yīng)一定時(shí)間，測定吸光度。以6中液體為參比，測定3、4的吸光度，分別得到A3和A0。以5中溶液為參比，測定1、2比色管中的吸光度，得到A2和A1。在1號比色管中加入不同體積的馬蹄皮提取液，按相同的方法測定吸光度，得到不同的羥自由基的清除率[16]。

式中：A1為是加入馬蹄皮樣液未加入雙氧水的吸光度；A2為加入馬蹄皮樣液之后加入雙氧水后的吸光度；A0為亞鐵離子和鄰二氮菲體系的吸光度；A3為加入了雙氧水的亞鐵離子和鄰二氮菲體系的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬蹄皮提取液的紫外可見光譜圖

根據(jù)1.2.1的方法得到馬蹄皮提取液，用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，得到圖1C線。取一定量的鄰二氮菲和一定量的硫酸亞鐵銨溶液混合，定容。用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，得到圖1B線。

圖1 馬蹄皮提取液和Fe2+/鄰二氮菲體系可見光區(qū)光譜掃描圖Fig.1 Visible spectrum scan of water chestnut peel and Fe2+/1，10-Phenanthroline system

由圖1可看出，F(xiàn)e2+/鄰二氮菲體系在510 nm處有最大吸收峰，而馬蹄皮提取液則在該波長處沒有明顯吸收，說明在510 nm時(shí)，提取液中的成分對Fe2+/鄰二氮菲體系的吸光度無干擾。

2.2 樣品濃度對清除羥自由基的影響

按照1.2.2所述，在1、2、5號比色管中分別加入不同體積的樣液，在1、2、3、4號加入0.5 mL的硫酸亞鐵銨和0.5 mL鄰二氮菲，在1、3號加入0.5 mL雙氧水溶液，定容至刻度，在37℃反應(yīng)一小時(shí)，測定吸光度。由于抗壞血酸價(jià)格低廉，抗氧化性能優(yōu)異，是較常見的抗氧化性，所以用抗壞血酸代替提取液做對比試驗(yàn)，用同樣的方法得到吸光度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 加入不同體積的馬蹄皮提取液的羥自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of different volume of water chestnut peel extracted liquid

由圖2可以看出馬蹄皮提取液在濃度為1.5 mg/mL～2.4 mg/mL具有明顯的量效關(guān)系，且清除率都在50%以上，在大于2.4 mg/mL后清除率基本不變，這就說明提取液的濃度大于2.4 mg/mL時(shí)對羥自由基清除率沒有太大影響。在實(shí)際應(yīng)用中，考慮符合經(jīng)濟(jì)效益，建議使用2.4 mg/mL的用量，節(jié)省試劑用量?？箟难嵩诩尤? mL時(shí)達(dá)到最大值，提取液與之相比要達(dá)到最大值用量要多一些，但是清除率達(dá)到50%以上。這個(gè)說明馬蹄皮提取液的清除能力還是可以的，具有相當(dāng)好的發(fā)展前景。

2.3 時(shí)間對提取液的清除率的影響

按照1.2.2所述，在1、2、5號比色管中分別加一定量的樣液，在1、2、3、4號加入0.5 mL的硫酸亞鐵銨和0.5 mL鄰二氮菲，在1、3號加入0.5 mL雙氧水溶液，定容至刻度，在37℃反應(yīng)不同時(shí)間，測定吸光度。用抗壞血酸代替提取液用同樣的方法得到吸光度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)不同時(shí)間的羥自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of hydroxyl radical at different time

由圖3可以看出，馬蹄皮提取液在反應(yīng)1 h的時(shí)候達(dá)到最大清除率，提取液在反應(yīng)1 h內(nèi)的清除率雖然在增長，但是清除率依然大于50%，清除效果較明顯。反應(yīng)時(shí)間大于1 h候清除率急劇下降，說明時(shí)間對提取液的抗氧化性影響很大。時(shí)間對抗對壞血酸的清除率沒有太大影響，在時(shí)間方面抗壞血酸比提取液穩(wěn)定。

2.4 溫度對清除率的影響

按照1.2.2所述，在1、2、5號比色管中分別加一定量的樣液，在1、2、3、4號加入0.5 mL的硫酸亞鐵銨和0.5 mL鄰二氮菲，在1、3號加入0.5 mL雙氧水溶液，定容至刻度，在不同溫度下反應(yīng)1 h，分別測定吸光度。用抗壞血酸代替提取液用同樣的方法得到吸光度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度下的馬蹄皮羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate at different temperatures.

由圖4可知，25℃到50℃對馬蹄皮提取液的抗氧化性具有一定的規(guī)律性，在37℃時(shí)達(dá)到最大清除率?？箟难釋囟鹊拿舾泻吞崛∫夯疽恢?，在只改變溫度的條件下馬蹄皮提取液可以代替抗壞血酸。

37℃正好是人體的溫度，有可能在臨床上對疾病的治療有應(yīng)用，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，達(dá)到最大清除率的溫度不是太高，燃料能耗偏低，有發(fā)展前景。

高溫對馬蹄皮提取液的影響很大，在溫度到達(dá)50℃以上，馬蹄皮提取液會出現(xiàn)沉淀，溫度越高，沉淀越多，隨著溫度的升高雙氧水也會分解。但在高溫下雙氧水可能可以在一定程度上抑制馬蹄皮提取液沉淀的形成，因?yàn)樵囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)加了雙氧水的沉淀要比不加雙氧水的沉淀少。

2.5 pH值對清除率的影響

按照1.2.2所述，在1、2、5號比色管中分別加一定量的樣液，在1、2、3、4號加入0.5 mL的硫酸亞鐵銨和0.5 mL鄰二氮菲，在1、3號加入0.5 mL雙氧水溶液，用不同pH值的溶液定容至刻度，在一定溫度下反應(yīng)1 h，分別測定吸光度。用抗壞血酸代替提取液用同樣的方法得到吸光度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH值下的羥自由基的清除率Fig.5 Hydroxy free radical clearance under different pH

由圖5看出，馬蹄皮提取液在pH值小于5時(shí)清除率呈遞增趨勢，并在pH值為5時(shí)達(dá)到最大值。而后隨著pH值的增大而減小，在堿性環(huán)境里清除率基本不變，但是清除率也有35%。說明提取液的抗氧化性具有一定的耐堿性?？箟难岬淖畲笾党霈F(xiàn)在pH值為7.4點(diǎn)。但是在pH值為1時(shí)溶液的紅色變?yōu)榱司G色，這時(shí)的吸光度對清除率沒有具體的意義，抗壞血酸已經(jīng)失去了抗氧化性。所以馬蹄皮提取液抗氧化性的耐酸性要比抗壞血酸好。從另一個(gè)角度可以看出，提取液在不同的pH溶液中比較穩(wěn)定，這對生產(chǎn)操作中有利。

3 結(jié)論

本文主要是對馬蹄皮提取液的抗氧化性的穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明濃度大于2.4 mg/mL后對馬蹄皮提取液的抗氧化性無明顯影響，在反應(yīng)1 h、37℃、pH值為5時(shí)羥自由基清除率到最大，且馬蹄皮提取液具有一定的耐酸、耐堿性。

與抗壞血酸相比，馬蹄皮來源豐富，屬于廢物利用，更符合經(jīng)濟(jì)效益?？箟难岬哪退嵝詻]有馬蹄皮提取液好，且馬蹄皮在其他條件下和抗壞血酸的規(guī)律基本一樣，所以馬蹄皮提取液有可能成為抗壞血酸的代替品。這些結(jié)果希望能為馬蹄皮的發(fā)展利用提供理論參考。

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Study on Stability of Antioxidation from Extract of Water Chestnut Peel

CHEN Qiu-juan1，XIE Wei2，*，LUO Yang-he2
（1.School of Chemical and Biological Engineering，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.Research Institute of Food Science&Engineering Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China）

The effectors of concetration，temperature，time and potential of hydrogen affecting antioxidation stability of water chestnut peel extracted liquid were studied.The result was showed that time，temperature and potential of hydrogen had a great effect on the antioxidation stability of water chestnut peel extracted liquid.However，concetration had no effect on it when the concetration was more than 2.4 mg/mL.When the temperature was 37℃，pH was 5 and reaction time was 1 hour，clearance rate of hydroxyl free radical was biggest and chufa peel extracted liquid can be acid-proof and alkali-proof.The antioxidation stability of water chestnut peel extracted liquid was similar to ascorbic acid stability，so it was take place of ascorbic acid.

water chestnut peel；antioxidation；hydroxyl radical

2016-09-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.003

廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KY2015LX477）；賀州學(xué)院校級課題（2014ZC28）；廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（KY2016LX381）；賀州學(xué)院教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目（hzxyjg201541，hzxyjg201636）

陳秋娟（1983—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取、純化與分析。

*通信作者：謝微，女（壯），助理研究員，研究方向：分析檢測。