于文娜，張振凌，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州450003）

鮮地黃花不同部位環(huán)烯醚萜苷類成分含量測定

于文娜，張振凌*，李柯柯，劉艷，王勝超，趙丹

（河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州450003）

比較鮮地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，為地黃花的藥用及食用提供一定參考。采用 HPLC法測定，Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梓醇：流動相乙腈-水（1∶99），流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃，進樣10 μL。毛蕊花糖苷：流動相乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82），流速1 mL/min，檢測波長 334 nm，柱溫 30 ℃，進樣 20 μL。地黃苷 D、益母草苷：SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長 203 nm；進樣 20 μL。梓醇含量：花瓣>花梗>花托，最高為9.52%；毛蕊花糖苷含量：花瓣>花托>花梗，最高為0.53%；地黃苷D含量：花瓣>花梗>花托，最高為0.09%；益母草苷含量：花托>花梗>花瓣，最高為0.19%。地黃花中不同部位其有效成分含量存在顯著差異。

地黃花；不同部位；梓醇；毛蕊花糖苷；地黃苷D；益母草苷

地黃花為玄參科植物地黃的花蕾，其功效與作用為治消渴，腎虛腰痛[1]。《本草圖經》記載：“為末服食，功同地黃。”《綱目》曰：“治腎虛，腰脊痛，為末酒服方寸匕，日三。”且《圣濟總錄》中有地黃花粥的記載。近年來，地黃花也被用于藥膳偏方之中，如地黃花粥可治療消渴癥等。環(huán)烯醚萜苷類化合物梓醇和苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷是地黃藥材質量評價的指標性成分。且現(xiàn)代藥理研究表明梓醇具有神經保護、降血糖、利尿、緩瀉、抗癌、抗炎等作用[2]；毛蕊花糖苷具有雄性激素樣作用[3]，以及抗氧化、抗腫瘤、增強心血管活性等作用[4]；地黃苷等環(huán)烯醚萜苷成分研究較多，具有明顯的補血作用，尤其對骨髓造血功能具有促進作用[5]。因此本試驗通過HPLC法測定地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量，并進行比較分析，以期為地黃花的藥用及食用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FW-200型高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；e2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.2 材料與試劑

鮮地黃花采自河南省溫縣宛西地黃種植基地，經河南中醫(yī)藥大學生藥學科董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）的新鮮花蕾（冷凍干燥品）；梓醇標準品（生產批號110808-201210）、毛蕊花糖苷標準品（生產批號111530-201411）：中國食品藥品檢定研究院；地黃苷D標準品（生產批號Y19J6F1）、益母草苷標準品（生產批號L10A6Y2298）：上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 梓醇色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（1 ∶99）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃。進樣量10 μL，色譜圖見圖1。

圖1 鮮地黃花HPLCFig.1 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.2 毛蕊花糖苷色譜條件

Waters-Symmetry ShieldTMRP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%醋酸溶液（18∶82）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長334 nm，柱溫30℃。進樣量20 μL，色譜圖見圖2。

圖2Fig.2 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.1.3 地黃苷D、益母草苷色譜條件

SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（3∶97）為流動相；流速 1 mL/min；柱溫 30℃；檢測波長203 nm；進樣量：20 μL，色譜圖見圖3。

圖3 鮮地黃花HPLCFig.3 HPLC of fresh rehmanniae flowers

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取適量梓醇及毛蕊花糖苷對照品于5 mL和10 mL容量瓶中，地黃苷D及益母草苷標準品于2 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.93 mg/mL的梓醇對照品溶液，1.01 mg/mL的毛蕊花糖苷對照品溶液，0.29 mg/mL的地黃苷D對照品溶液及0.39 mg/mL的益母草苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 梓醇及毛蕊花糖苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托及花梗0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液（梓醇10 mL，毛蕊花糖苷20 mL）于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，殘渣用流動相溶解并定容至10 mL（梓醇）和5 mL（毛蕊花糖苷）容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2 地黃苷D及益母草苷供試品溶液制備

分別取地黃花瓣，花托，花梗約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇水溶液100 mL，輕輕振搖使其與溶劑充分接觸并混勻，稱定重量，超聲輔助提?。?0 kz，500 W）40 min，取出冷卻至室溫，稱定重量，以提取溶劑補足失重，過濾，棄去初濾液，精密量取20 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，60℃水浴濃縮至近干，以流動相溶解并定容至5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取梓醇，毛蕊花糖苷對照品溶液1、5、10、15、20 μL，地黃苷 D 及益母草苷對照品溶液 1、3、5、7、9 μL，按 2.1 項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，得線性回歸方程分別為Y=260 336X-39 493（R2=0.999 8），Y=2×106X-690 748（R2=0.999 9），Y=513 027X-46 894（R2=1.000），Y=542 565X-71 693（R2=1.000），線性范圍依次為 0.93 μg～18.6 μg、1.01 μg～20.2 μg、0.29 μg～2.61 μg、0.39 μg～3.51 μg。

2.5 精密度試驗

取地黃花瓣供試品溶液，按2.1項下色譜條件，計算梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.91%、0.52%、1.47%、1.88%。說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取地黃花瓣樣品，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為0.58%、1.72%、0.34%、0.27%。說明該方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取地黃花瓣供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h按2.1項下色譜條件進樣，結果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷峰面積積分值的RSD分別為1.15%、0.47%、0.46%、0.30%。表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取地黃花托6份，每份0.4 g，分別精密加入梓醇（4.01 mg/mL）5 mL，毛蕊花糖苷（1.47 mg/mL）對照品溶液1 mL，以2.3.1項下方法制備供試品溶液；取地黃花托6份，每份0.5 g，分別精密加入地黃苷D（0.26 mg/mL）1 mL，益母草苷（0.97 mg/mL）1 mL對照品溶液，以2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，結果梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷回收率RSD值分別為1.28%、1.23%、0.80%、0.93%，說明回收率良好，該方法準確可靠。梓醇及毛蕊花糖苷具體結果見表1。

表1 梓醇及毛蕊花糖苷加樣回收試驗結果Table 1 Recovery tests of catalpol，verbascoside in fresh of rehmanniae flowers

2.9 樣品測定

取地黃花瓣，花托，花梗樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，平行3份，根據水分測定結果換算為干燥品計算地黃花不同部位中梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷的含量，取平均值，結果見表2。

表2 地黃花不同部位梓醇，毛蕊花糖苷，地黃苷D及益母草苷含量測定Table 2 Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers

結果表明梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D以地黃花瓣中含量最高，益母草苷在地黃花托中含量為最高。

3 討論

本試驗在藥典法的基礎上，對地黃花不同部位梓醇及毛蕊花糖苷進行含量測定，對梓醇含量測定流動相進行調整，最終采用乙腈-水（1∶99）；同時調整毛蕊花糖苷含量測定流動相比例為乙腈-0.1%醋酸（18∶82）。在相關研究文獻[6-7]的基礎上，采用HPLC法同時測定地黃花中地黃苷D及益母草苷3種有效成分含量，并適當調整流動相比例，最終確立采用乙腈-水（3 ∶97）。

本研究采用的新鮮地黃花樣品，因其不易保存，故均通過本試驗室冷凍干燥設備自制成地黃花冷凍干燥品，以備試驗使用。由試驗結果可知，地黃花不同部位梓醇等有效成分含量雖存在很大差異，但其含量均較高。其中梓醇，毛蕊花糖苷及地黃苷D含量在地黃花瓣中為最高，分別為9.52%、0.53%、0.09%，益母草苷含量則在地黃花托中為最高，0.19%。這不僅說明在以地黃花為材料的藥膳偏方對于相關疾病的輔助治療方面有一定現(xiàn)實應用價值，而且也為地黃花的使用提供理論和科學依據。且梓醇，毛蕊花糖苷等是地黃中的主要有效成分，通過比較地黃花不同部位（花瓣，花托及花梗）有效成分含量，發(fā)現(xiàn)均超過相關文獻[8-9]鮮地黃中梓醇等有效成分含量，可考慮將地黃花入藥或者作為提取物的制備原料，為地黃擴大藥源及食品相關領域提供參考。

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(上冊)[M].上海：上海科學技術出版社,1985：826

[2]劉彥飛,趙宇,溫學森,等.梓醇的藥效學及化學轉化研究現(xiàn)狀[J].中國中藥雜志,2007,31(12)：1128-1130

[3]何偉,宗桂珍,武桂蘭,等.肉蓯蓉中雄性激素樣作用活性成分的初探[J].中國中藥雜志,1996,9(9)：52-53

[4]Zhang H Q,Lai Y L.Acteaside inhibits apoptosis in a D-galactasam ine and lipopolysaccharide-induced liver injury[J].Life Sci,1999,65(4)：421

[5]于震,王軍,李更生,等.地黃甙D滋陰補血和降血糖作用的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2001(4)：240-242

[6]劉炯,張杰,張華鋒,等.HPLC測定不同品種懷地黃中地黃苷A、D的含量[J].藥物分析雜志,2014(2)：335-339

[7]李更生,劉明,王慧森,等.地黃藥材炮制過程中環(huán)烯醚萜苷類成分動態(tài)變化的研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2008(6)：440-442

[8]吳若男,張振凌,劉艷,等.微波干燥對鮮地黃中地黃苷A,D和益母草苷含量的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2016(8)：28-31

[9]王宏潔,金亞紅,李鵬躍,等.鮮、生、熟地黃藥材中3種活性成分含量的比較[J].中國中藥雜志,2008(15)：1923-1925

Determination of the Content of Iridoid Glycosidein from Different Parts of the Fresh Rehmanniae Flowers

YU Wen-na，ZHANG Zhen-ling*，LI Ke-ke，LIU Yan，WANG Sheng-chao，ZHAO Dan
（Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Compared the contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride in rehmanniae flowers，for the flower's medicinal and edible aspects provide certain reference.Contents of catalpol，verbascoside ，rehmaionoside D and leonuride were determined by HPLC，Waters-Symmetry ShieldTMRP18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），catalpol：a mobile phase of acetonitrile-water （1 ∶99）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 210 nm，sample volume10μL.Verbascoside：a mobile phase of acetonitrile-0.1%acetic acid solution （18 ∶82）as mobile phase，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 334 nm，sample volume 20 μL.Rehmaionoside D and leonuride：SunFireTMC18 column（4.6 mm × 250 mm，5 μm），a mobile phase of acetonitrile-water （3 ∶97）was used，flow rate was 1 mL/min，column temperature was set at 30 ℃ ，a UV detector was applied with wavelength of 203 nm，sample volume 20 μL.The content of catalpol content：petals>pedicel>receptacle，as high as 9.52%；verbascoside content：petals>receptacle>peduncle，up to 0.53%；rehmaionoside D levels：petals>pedicel>receptacle，as high as 0.09%；leonuride content：receptacle>pedicel>petals，as high as 0.19%.There are significant differences among different parts of the active ingredient content of rehmanniae flowers.

fresh rehmannine flowers；different parts；catalpol；verbascoside；rehmaionoside D；leonuride

2016-10-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.028

公益性科研專項項目（201507002）；科研創(chuàng)新基金項目（教科計[2013]638號）

于文娜（1990—），女（漢），在讀研究生，研究方向：中藥飲片及新藥研究。

*通信作者：張振凌，從事中藥飲片及新藥研究。