王麗霞，王賢龍，王玉玲，潘一山，王少峰

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000；2.漳州金三角生物科技有限公司，福建漳州363000）

超聲波輔助提取玫瑰茄色素的工藝研究

王麗霞1，王賢龍1，王玉玲1，潘一山1，王少峰2

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000；2.漳州金三角生物科技有限公司，福建漳州363000）

采用超微粉碎技術(shù)處理玫瑰茄干花萼。選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率、液料比為自變量，花色苷含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果表明：玫瑰茄紅色素適宜的提取工藝條件為：超聲時間33.26 min，超聲溫度47.23℃，超聲功率57.98%，液料比128.73∶1（mL/g），該試驗條件下花色苷含量的預(yù)測值為4.66 mg/g。依據(jù)實際試驗情況，將其修正為超聲時間30 min、超聲溫度50℃，超聲功率60%即120 W、液料比130∶1（mL/g），經(jīng)驗證此條件下花色苷實際提取量為4.63 mg/g，實際值接近理論預(yù)測值，說明響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄色素提取工藝參數(shù)的可行性。超聲聯(lián)合超微粉碎可以顯著提高玫瑰茄紅色素的提取率。

玫瑰茄色素；超微粉碎；超聲波；提取

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名山茄、蘇丹紅、美麗納[1]，屬錦葵科木槿屬一年生草本植物[2]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國的廣東、廣西、福建、云南、臺灣等地均有栽培。玫瑰茄含有豐富的蛋白質(zhì)、有機酸、維生素C、多種氨基酸、大量的天然色素及多種礦物質(zhì)[3]。具有很高的藥用和食用價值，如：降血壓[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、護肝[7]、利尿通便[8]、保護心血管、降膽固醇[9]等。

其含有的花青素屬酚類化合物中的類黃酮類，主要成分為飛燕草素-3-接骨木二糖苷、矢車菊-3-接骨木二糖苷[10]，是一種良好的氧游離基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，可有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，也參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護脂質(zhì)不發(fā)生過氧化損傷，是目前世界上發(fā)現(xiàn)的清除自由基最有效的物質(zhì)之一[2]，具有一定的營養(yǎng)和藥理作用，有較高的安全性能，而且具有抗突變、抗氧化、降血壓、保護肝臟等保健功能，被廣泛用于功能性食品和保健品的原料和著色，含花青素的植物提取物已被意大利、德國等國家的藥典收載[10]。

玫瑰茄紅色素作為天然的色素，應(yīng)用越來越廣泛，社會需求量很大。研究玫瑰茄花色素，有利于玫瑰茄的開發(fā)利用，提高其綜合利用價值，帶動產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。目前，關(guān)于玫瑰茄紅色素的提取已有研究報道，提取方法為超聲波輔助提取[1，11-13]、溶劑提取[14-15]及微波提取[16-17]，但是普遍存在提取率不高、提取時間長[14-16]、溶劑消耗大[14-15]等問題。本文采用超微粉碎輔助超聲波提取玫瑰茄色素，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期縮短提取時間、提高提取率。

1 材料與方法

1.1 材料

玫瑰茄干花萼：由漳州金三角生物科技有限公司提供；蒸餾水：閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物實驗教學(xué)示范中心。

1.2 儀器與設(shè)備

WK-150全新氣流式超微粉碎機：欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司；AR224CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；RO DI實驗室超純水機：上海和泰儀器有限公司；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-1750紫外分光光度計：廈門精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰茄色素的提取工藝

將玫瑰茄干花萼放入超微粉碎機中粉碎，置于棕色瓶內(nèi)在4℃條件下密封保存?zhèn)溆谩７Q取適量玫瑰茄干花萼微粉加入蒸餾水于超聲波清洗器中超聲處理，提取液冷凍離心得上清液，測吸光度，計算色素提取率。

1.3.2 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定提取花色苷的含量[18]。計算公式為：

式中：ρ為花色苷提取量，mg/g；A0、A1分別為 pH 1.0、pH 4.5時花色苷在520 nm波長處的吸光度；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，29 600；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 超聲波時間對吸光度的影響

稱取0.30 g玫瑰茄干花萼細粉5份于三角瓶中，加入蒸餾水50 mL，在30℃、超聲波功率100%即200 W，超聲時間分別為 20、30、40、50、60 min 的條件下提取玫瑰茄色素，冷凍離心，在520 nm波長下測定上清液吸光度[12]，計算花色苷含量。

1.3.3.2 超聲波溫度對吸光度的影響

稱取0.30 g玫瑰茄干花萼細粉5份于三角瓶中，加入蒸餾水50 mL，設(shè)置超聲波溫度為30、40、50、60、70℃，超聲時間30 min，超聲波功率100%即200 W的條件下提取玫瑰茄色素，冷凍離心，在520 nm波長下測定上清液吸光度，計算花色苷含量。

1.3.3.3 超聲波功率對吸光度的影響

稱取0.30 g玫瑰茄干花萼細粉5份于三角瓶中，加入蒸餾水50 mL，超聲波溫度為50℃，分別在超聲波功率為 80 W（60%）、100 W（50%）、120 W（60%）、140 W（70%）、160 W（80%）、180 W（90%）下，超聲時間30 min的條件下提取玫瑰茄色素，冷凍離心，在520 nm波長下測定上清液吸光度，計算花色苷含量。

1.3.3.4 液料比的選擇

稱取0.50 g玫瑰茄干花萼細粉5份于三角瓶中，分別加入蒸餾水 40、50、60、70、80、90 mL 即液料比[蒸餾水用量（mL）∶玫瑰茄質(zhì)量（g）]80 ∶1、100 ∶1、120 ∶1、140 ∶1、160 ∶1、180 ∶1。超聲波時間 30 min，超聲波溫度50℃，超聲波功率120 W（60%）的條件下提取玫瑰茄色素，冷凍離心，在520 nm波長下測定上清液吸光度，計算花色苷含量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.05b軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，優(yōu)化玫瑰茄色素提取的最佳條件。以吸光值為指標(biāo)，以超聲波時間、超聲波溫度、超聲功率、液料比4個因素為自變量，設(shè)計四因素三水平29個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，以得出最佳的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波時間對吸光度的影響

超聲波時間對花色苷提取量的影響見圖1。

由圖1可以看出，超聲波時間在30 min以內(nèi)，花色苷提取量隨著時間的增加呈線性上升，說明色素在不斷溶出，在30 min左右色素溶出完全，花色苷含量達到最大。之后，隨時間增加花色苷提取量有所降低，這可能是由于超聲波的震動能量改變了色素的結(jié)構(gòu)[19]，也可能玫瑰茄色素不穩(wěn)定，隨著提取時間延長，空氣的氧化作用使花色苷溶液分解褪色[20]。因此，超聲時間選為30 min。

圖1 超聲波時間對花色苷提取量的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time on the extraction yield of anthocyanins

2.1.2 超聲波溫度對吸光度的影響

超聲波溫度對花色苷提取量的影響見圖2。

圖2 超聲波溫度對花色苷提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the extraction yield of anthocyanins

由圖2可以看出，作用溫度在50℃以下，花色苷提取量隨溫度的增大而增大，在較低溫度下，超聲即可使玫瑰茄色素溶出，并且隨超聲溫度升高色素溶出率增大，至50℃時達到最大，之后，隨著作用溫度的增大花色苷提取量反而降低，這是由于玫瑰茄色素在溫度較高的情況下易變性而遭到破壞。且當(dāng)溫度超過60℃時，由于水分蒸發(fā)，液料比也會發(fā)生變化。因此，超聲波溫度選為50℃。此結(jié)論與涂佘財[11]、丁敬爭等[12]的研究結(jié)果一致。

2.1.3 超聲波功率對吸光度的影響

超聲波功率對花色苷提取量的影響見圖3。

由圖3可以看出，隨著超聲波功率的增加，花色苷提取量呈先上升后下降趨勢，當(dāng)超聲波輸出功率為120 W（60%）時，花色苷提取量達最大值。這是由于超聲波功率過大時，產(chǎn)生劇烈的振動，造成花色苷的糖苷分離[19]，即分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致花色苷含量降低。因此，超聲波功率選為60%即120 W。

2.1.4 液料比對吸光度的影響

液料比對花色苷提取量的影響見圖4。

圖3 超聲波功率對花色苷提取量的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of anthocyanins

圖4 液料比對花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of anthocyanins

由圖4可以看出，隨著液料比的增加，花色苷含量先增加，這是由于當(dāng)溶劑較少時，玫瑰茄色素溶解不完全，隨著液料比增加，色素能夠充足的溶解在較多的溶劑中，但是當(dāng)溶劑繼續(xù)增加時，花色苷含量稍微降低，這可能是由于色素在高濃度時分子之間存在自聚作用使其比較穩(wěn)定，而增加溶劑時，色素濃度降低以致色素分子之間的作用力變?nèi)?，其穩(wěn)定性下降而容易分解[21]，最后花色苷含量趨于平衡，說明色素已經(jīng)基本提取出來。因此，液料比選為140∶1（mL/g）。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert8.05b軟件中的Box-Behnken設(shè)計，以超聲波時間（A）、超聲波作用溫度（B）、超聲波功率（C）、液料比（D）為考察因素，設(shè)置四因素三水平試驗，每個因素低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，以提取的花色苷含量為響應(yīng)值，優(yōu)化玫瑰茄色素的超聲波提取工藝參數(shù)。因素水平見表1。響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.2.2 回歸方程的建立和顯著性分析

以花色苷含量為響應(yīng)值對表2的試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得花色苷含量對超聲波時間（A）、超聲波作用溫度（B）、超聲波功率（C）、液料比（D）的二元回歸方程：

對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

從表4可知，模型P＜0.000 1，由此得出，響應(yīng)回歸模型達到了極顯著的水平，其中，失擬項P＝0.136 2＞0.05不顯著，說明模型擬合程度良好。模型校正系數(shù)R2＝0.981 7，模型修正系數(shù) R2Adj＝0.963 3，C.V.%=0.47，說明響應(yīng)值與因素之間建立的響應(yīng)值可靠，可用于理論預(yù)測。回歸系數(shù)顯著性的檢驗可以表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AB、BD 對花色苷含量有極顯著的影響，AC、AD對花色苷含量有顯著影響，其余不顯著；4個因素對吸光度的影響大小為：D＞B＞A＞C，即液料比＞超聲波溫度＞超聲波時間＞超聲波功率。

2.2.3 三維響應(yīng)曲面圖分析

以花色苷含量為評價指標(biāo)的回歸模型的響應(yīng)面圖見圖5～圖10。

圖5 超聲波時間和超聲波溫度的交互作用對花色苷含量的影響Fig.5 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and temperature on the yield of anthocyanins

圖6 超聲波時間和超聲波功率的交互作用對花色苷含量的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and power on the yield of anthocyanins

圖7 超聲波時間和液料比的交互作用對花色苷含量的影響Fig.7 Response surface plot showing the effects of ultrasonic time and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

由圖5～圖10可知，花色苷含量隨著超聲波時間、超聲波溫度、超聲波功率、液料比的增大均呈先上升后下降趨勢。其中超聲波時間和超聲波溫度、超聲波時間和超聲波功率、超聲波時間和液料比、超聲波溫度和液料比的交互作用對花色苷含量的影響顯著，其他交互作用不顯著。比較6組圖可知，液料比影響較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，花色苷含量隨其數(shù)值變化而迅速變化；超聲波功率影響最小，曲線比較平滑。

2.3 驗證試驗

圖8 超聲波溫度和超聲波功率的交互作用對花色苷的影響Fig.8 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and temperature on the yield of anthocyanins

圖9 超聲波溫度和液料比的交互作用對花色苷含量的影響Fig.9 Response surface plot showing the effects of ultrasonic temperature and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

圖10 超聲波功率和液料比的交互作用對花色苷含量的影響Fig.10 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and liquid/material ratio on the yield of anthocyanins

為了進一步驗證試驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，采用Design Expert 8.05b軟件對試驗進行典型性分析，得到玫瑰茄色素提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲波時間33.26 min，超聲波溫度47.23℃，超聲波功率57.98%，液料比128.73∶1（mL/g）。花色苷含量的預(yù)測值為4.66 mg/g?？紤]實際操作的可行性，將參數(shù)修正為：超聲波時間30min，超聲波溫度50℃，超聲波功率60%即120 W，液料比130∶1（mL/g）。并在此條件下，重復(fù)進行3次試驗，測得花色苷含量的平均值為4.63 mg/g，與預(yù)測值較接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄色素提取工藝參數(shù)的可行性。曾哲靈等[15]采用40%乙醇提取1.52h，得花色苷含量為4.876 mg/g，相比而言，本文采用超微粉碎輔助超聲波聯(lián)合提取玫瑰茄紅色素，直接以水為溶劑，提取時間30 min，色素提取率達到4.63 mg/g，避免了使用乙醇等溶劑，提取時間短，提取率高。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定玫瑰茄色素提取的最佳工藝條件為：超聲波時間30 min，超聲波溫度50℃，超聲波功率60%即120 W，液料比130∶1（mL/g）。影響超聲波提取的主次因素依次為液料比、超聲波溫度、超聲波時間和超聲波功率。超聲波聯(lián)合超微粉碎可以顯著提高玫瑰茄紅色素的提取率。

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Study on Ultrasonic-assisted Extraction of Pigment from Roselle

WANG Li-xia1，WANG Xian-long1，WANG Yu-ling1，PAN Yi-shan1，WANG Shao-feng2
（1.Department of Biology Science and Technology，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China；2.Zhangzhou Gold Saga Bio-technology CO.，LTD.，Zhangzhou 363000，F(xiàn)ujian，China）

Roselle dried calyx was treated by ultrafine comminution.Ultrasonic time，temperature，power and the ratio of liquid to material were selected as independent variables.The extraction yield of anthocyanins was selected as response value to conduct the optimization of response surface design.The optimum conditions of extraction obtained by response surface methodology were as followed：ultrasonic time of 33.26 min，ultrasonic temperature at 47.23℃，ultrasonic power of 57.98%，and liquid/material ratio of 128.73 mL/g.Under these conditions，the theoretic anthocyanins yield reached 4.66 mg/g.According to the actual experiments，the optimum theoretic parameters were modified as：ultrasonic time 30 min，ultrasonic temperature 50℃，ultrasonic power 60%，namely 120 W，and liquid/material ratio 130∶1（mL/g），and the actual extraction rate of anthocyanins was 4.63 mg/g，which was close to the predicted value.The results showed that the response surface method to optimize the ultrasonic-assisted extraction of roselle pigment was feasible.Ultrasonic and ultrafine comminution had a significant effect on extraction ratio of roselle pigment.

roselle pigment；ultrafine comminution；ultrasonic；extraction

2016-12-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.009

福建省高校科技計劃重點項目（產(chǎn)學(xué)研項目）（2015N5003）

王麗霞（1979—），女（漢），副教授，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工、多糖結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)性等方面的研究。