湯杰印，董 楊，張祥貴，肖 寒，張 薇，徐麗君

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東珠海 519100)

論著·基礎(chǔ)研究

商陸皂苷甲對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞ERK1/2-AP-1通路活化的影響

湯杰印，董 楊，張祥貴△，肖 寒，張 薇，徐麗君

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東珠海 519100)

目的 觀察商陸皂苷甲(EsA)含藥血清對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(rGMC)增殖及其對(duì)IL-1β誘導(dǎo)rGMC的ERK1/2-AP-1通路活化的影響。方法 用不同劑量EsA(5、10、20、40 mg/kg)將SD大鼠灌胃后獲取含藥血清，并設(shè)對(duì)照組(0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃)；用上述各組濃度的EsA含藥血清處理rGMC，并設(shè)對(duì)照組血清組。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組EsA含藥血清對(duì)rGMC增殖的影響；將rGMC分為空白對(duì)照組、IL-1β單獨(dú)作用組、IL-1β+EsA雙重作用組、IL-1β+U016雙重作用組、IL-1β+U0126+EsA共同作用組，同步化后培養(yǎng)48 h，Western Blot法檢測(cè)p-ERK1/2、AP-1的表達(dá)并成像分析。結(jié)果 EsA(5～10 mg/kg)含藥血清抑制了細(xì)胞增殖(P<0.05或P<0.01)；IL-1β組促進(jìn)了rGMC的p-ERK1/2、AP-1表達(dá)(P<0.05)，IL-1β+EsA組、IL-1β+U0126組，IL-1β+U0126+EsA組作用rGMC后，其p-ERK1/2、AP-1表達(dá)均降低(P<0.05)。結(jié)論 EsA含藥血清(5～10 mg/kg)顯著抑制了rGMC的増殖；EsA通過下調(diào)p-ERK1/2、AP-1表達(dá)，抑制了IL-1β誘導(dǎo)的rGMC增殖，EsA作用于ERK1/2-AP-1通路是其抑制rGMC增殖的機(jī)制之一。

商陸皂苷甲；細(xì)胞增殖；系膜細(xì)胞；AP-1；ERK1/2

腎小球系膜細(xì)胞的過度增生是導(dǎo)致慢性腎臟病不斷進(jìn)展的重要原因，在系膜細(xì)胞增生的過程中常伴有細(xì)胞外基質(zhì)在系膜區(qū)的沉積，從而引起腎小球?yàn)V過率的持續(xù)性降低，大量的腎小球硬化導(dǎo)致腎功能不全，最終進(jìn)展到腎病終末期。因此，推斷如果能夠抑制或阻斷系膜細(xì)胞的增殖過程則系膜細(xì)胞增生性腎小球腎炎的病理生理過程將能夠得到逆轉(zhuǎn)，慢性腎衰竭也將能夠在很大程度上得以避免。大量研究結(jié)果表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活在引起系膜細(xì)胞增殖過程中起到關(guān)鍵的作用，而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)通路的激活則是MAPK通路啟動(dòng)、發(fā)揮作用的核心環(huán)節(jié)[1]，在ERK1/2通路中激活蛋白-1 (AP-1)的作用尤為突出，可以推斷抑制ERK1/2-AP-1通路的激活將能夠?yàn)榉乐我韵的ぜ?xì)胞增生為發(fā)病核心的腎臟疾病提供新的臨床途徑。商陸皂苷甲(EsA)是中藥商陸的單體形式，大量的臨床研究證實(shí)其在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖的多種病理生理調(diào)節(jié)過程中起著積極作用[2-4]，尤其是對(duì)于自身免疫性腎炎動(dòng)物模型的臨床實(shí)驗(yàn)性治療效果令人滿意[5]。本課題組前期大量的動(dòng)物模型臨床試驗(yàn)研究結(jié)果已尋找到EsA顯著改善小鼠狼瘡性腎炎模型機(jī)體炎癥，蛋白尿及腎功能癥狀隨之緩解的臨床證據(jù)，且發(fā)現(xiàn)此過程中小鼠疾病模型血清中TNF-a，IL-6的含量顯著下降[6]；在腎臟組織內(nèi)Bcl-2和PCNA的表達(dá)顯著受阻，而Fas、FasL及Caspase-3基因被充分激活，促使腎小球內(nèi)有核細(xì)胞及系膜區(qū)面積的減低，充分延緩、逆轉(zhuǎn)了腎組織的增殖過程，腎臟病理?yè)p傷狀況得以逆轉(zhuǎn)[7-9]；EsA非含藥血清將能夠使P27基因活化水平顯著提高，從而使CDK2基因表達(dá)受阻，抑制了大鼠腎小球系膜細(xì)胞(rGMC)細(xì)胞分裂周期的進(jìn)程，抑制rGMC的增殖[10-11]。如今，鮮有EsA對(duì)GMC增殖的抑制過程經(jīng)ERK-AP-1信號(hào)通路而發(fā)揮作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察了EsA含藥血清對(duì)rGMC增殖及其對(duì)IL-1β誘導(dǎo)rGMC的p-ERK1/2、AP-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討、闡明EsA治療系膜細(xì)胞增殖性腎小球疾病的潛在關(guān)鍵分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠[美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物許可證：SCXK(京)2012-001]；rGMC株(HBZY-1)由CCTCC提供。IL-1β(peprotechlot)，生產(chǎn)批號(hào)：100991E0713；EsA(上海源葉公司)，生產(chǎn)批號(hào)：KM0521CA14；優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Thermo公司)，二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Aladdin)，0.25%胰酶溶液(含酚紅、EDTA)(碧云天生物技術(shù)研究所)，U0126(Sigma公司)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(天津大茂化學(xué)試劑廠)，RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，HRP標(biāo)記山羊抗兔(武漢博士德)，AP-1兔抗鼠IgG抗體(武漢谷歌生物科技)，p-ERK1/2兔抗鼠IgG抗體(北京博奧森)，蛋白Marker(凱基生物)。

1.2 方法和分組

1.2.1 EsA混懸液制備 用電子天平精確量取EsA和2 mL 0.5%CMC-Na溶液充分混勻，即得到實(shí)驗(yàn)用EsA混懸液。

1.2.2 EsA含藥血清制備 將體質(zhì)量為(248±22)g的20只清潔級(jí)健康8周齡實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠，使用隨機(jī)序列發(fā)生器分配到對(duì)照組(0.5%CMC-Na灌胃)，5 mg/kg EsA血清組，10 mg/kg EsA血清組，20 mg/kg EsA血清組，40 mg/kg EsA血清組。專室分籠裸鼠飼料飼養(yǎng)，隨意飲食，每組4只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后進(jìn)行胃內(nèi)藥物灌注，大鼠在進(jìn)行灌藥前需禁食8 h，自由飲水。根據(jù)SD大鼠體質(zhì)量，將給藥組分別按總劑量5、10、20、40 mg/kg連續(xù)3 d進(jìn)行EsA混懸液胃內(nèi)灌注，每日進(jìn)行2次，掌握每次EsA混懸液的胃內(nèi)灌注量為總量1/6；對(duì)照組中使用與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的0.5% CMC-Na以便獲得無藥血清。最后一次胃內(nèi)灌注藥物結(jié)束之后1 h內(nèi)，無菌操作臺(tái)中采用經(jīng)腹主動(dòng)脈直視下取血，獲得全血后使之常溫下靜置充分凝固，分離血清，所得同組血清可混合，然后經(jīng)過滅活、過濾除菌之后分裝冷藏備用。

1.2.3 rGMC培養(yǎng) 原代rGMC細(xì)胞株，在倒置顯微鏡下呈梭形，平鋪于培養(yǎng)瓶底部，相互不重疊，培養(yǎng)基澄清、透亮，無黑點(diǎn)、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)可供用于后續(xù)試驗(yàn)。將其置于恒溫、恒濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)去除觀察，待rGMC鋪滿培養(yǎng)瓶底部面積的80%～90%時(shí)，棄去上清液，并使用2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞清洗兩遍，充分棄去PBS液后，加入500 μL胰酶溶液輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞與胰酶充分接觸，將之放入培養(yǎng)箱中3 min進(jìn)行消化，取出培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察可見rGMC細(xì)胞變圓形，部分從底部脫落，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，使用移液器輕輕反復(fù)吹打，即制備得到單細(xì)胞懸液。使用移液器將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，800 r/min充分離心5 min，棄上清液，再次添加3 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打，充分混勻。取3個(gè)25 mm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液4 mL，使用移液器向每個(gè)培養(yǎng)瓶中各加入上述細(xì)胞懸液1 mL，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之充分混勻，然后將培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5%CO2恒溫、恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每48 h需進(jìn)行換液，連續(xù)培養(yǎng)72 h可再次進(jìn)行細(xì)胞傳代。待傳代至6～9代rGMC時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分裂周期最為穩(wěn)定，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 研究EsA含藥血清對(duì)rGMC增殖的影響時(shí)，按照血清中EsA的含藥濃度分成：對(duì)照組、5 mg/kg EsA血清組、10 mg/kg EsA血清組、20 mg/kg EsA血清組和40 mg/kg EsA血清組；在研究EsA含藥血清對(duì)p-ERK1/2、AP-1表達(dá)的影響過程中分成空白對(duì)照組、IL-1β單獨(dú)作用組、IL-1β+EsA雙重作用組、IL-1β+U016雙重作用組，IL-1β+ESA+U016共同作用組。

1.2.5 MTT法檢測(cè)EsA對(duì)rGMC增殖影響 將傳代至6～9代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的rGMC接種到96孔板上，先使用無血清培養(yǎng)基在恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中孵育24 h使rGMC生長(zhǎng)期同步化在G0期?？瞻讓?duì)照組使用0.5% CMC-Na進(jìn)行灌胃處理的大鼠體內(nèi)獲取的血清，上述實(shí)驗(yàn)過程中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別待培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，進(jìn)行換液，并向每個(gè)孔中添加20 μL的0.5% MTT后將96孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)完成后棄上清液，在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)添加DMSO 150 μL，將培養(yǎng)板置于水平震蕩儀上，室溫下，振蕩10 min，使結(jié)晶顆粒完全溶解。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，設(shè)定490 nm波長(zhǎng)，對(duì)各細(xì)胞培養(yǎng)孔處的吸光光度值(OD值)進(jìn)行檢測(cè)(重復(fù)4次)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)p-ERK1/2表達(dá) 細(xì)胞傳代、換液、分組和藥物添加處理同前所述。將各實(shí)驗(yàn)組處理完畢，繼續(xù)培養(yǎng)48 h(生長(zhǎng)至約每組1×106個(gè)細(xì)胞)，提取各組細(xì)胞內(nèi)部總蛋白，BCA法對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中提取的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行檢測(cè)，提取完畢將蛋白樣品置于-20 ℃冰箱備用。使用時(shí)每組蛋白樣品20 μg同5×SDS凝膠加樣緩沖液充分混勻，置于100 ℃水浴箱中充分變性5 min。使用微量加樣器上樣，保證每個(gè)電泳孔中添加蛋白樣品等量，使用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(其中樣品通過濃縮膠時(shí)設(shè)定45 V，時(shí)間為 40 min；樣品通過分離膠時(shí)設(shè)定120 V，時(shí)間為 90 min)，轉(zhuǎn)膜過程中電流為350 mA，時(shí)間1 h，將樣品充分轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完成，取出PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的封閉液進(jìn)行封閉1 h；p-ERK1/2 IgG 抗體同封閉液按照1∶2 000的比例進(jìn)行稀釋，GAPD h 兔抗鼠IgG 抗體使用封閉液按照1∶1 000的比例進(jìn)行稀釋，將PCDF膜分切完畢，同所對(duì)應(yīng)的1抗封在封閉袋中，置于4 ℃水平恒溫震蕩儀中50 r/min孵育過夜；第2日，取出PVDF膜做好標(biāo)記，使用TBST進(jìn)行洗膜，洗膜結(jié)束，將PVDF膜與羊抗兔IgG- hRP 抗體(同封閉液按照1∶3 000進(jìn)行稀釋)共同封在封閉袋中，室溫下，水平震蕩儀上50 r/min，繼續(xù)孵育1 h。二抗孵育結(jié)束，使用TBST洗膜3遍，取出PVDF膜置于保鮮膜上，正確放置富士感光膠片，將之共同移入夾中，壓片2 min，顯影3 min，定影10 min。所獲取的曝光圖像條帶使用ImageJ 圖像軟件進(jìn)行灰度分析。GAPDH作為內(nèi)參條帶，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為各組蛋白質(zhì)的相對(duì)含量數(shù)值(上述過程重復(fù)3次)。

1.2.7 Western Blot檢測(cè)AP-1表達(dá) Western Blot實(shí)驗(yàn)方法同1.2.6所述，AP-1 IgG 一抗同封閉液按照1∶2 000進(jìn)行稀釋。二抗、圖像采集、處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等過程同1.2.6。

2 結(jié) 果

2.1 rGMC形態(tài)學(xué)觀察 使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察傳代24 h后的rGMC，可見其平鋪、舒展于細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶的底部，長(zhǎng)梭狀、不規(guī)則形，相互不重疊，卵圓形的細(xì)胞核居于包體中央，胞體周圍有大量樹枝狀突起，培養(yǎng)基澄清。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞間隙縮小，連續(xù)培養(yǎng)2～3 d后可鋪滿瓶底。見圖1。

2.2 EsA含藥血清對(duì)rGMC增殖的影響 同對(duì)照組相比，可觀察到5 mg/kg EsA血清組、10 mg/kg EsA血清組在24、48、72 h時(shí)rGMC的增殖受到顯著抑制(P<0.05)。尤其是10 mg/kg EsA血清作用組在48 h時(shí)rGMC增殖的抑制作用更為顯著(P<0.01)，并且觀察到細(xì)胞培養(yǎng)基澄清，單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，故后續(xù)試驗(yàn)可選用10 mg/kg EsA血清組，實(shí)驗(yàn)研究觀察點(diǎn)選擇為48 h。見表1。

圖1 正常培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)(×200)

組別nOD(24h)OD(48h)OD(72h)對(duì)照組50．648±0．0480．788±0．0371．245±0．0435mg/kgEsA血清組50．533±0．035a0．709±0．036a1．165±0．021a10mg/kgEsA血清組50．514±0．052a0．655±0．053b1．150±0．018b20mg/kgEsA血清組50．662±0．0720．850±0．0291．299±0．07540mg/kgEsA血清組50．726±0．1260．856±0．0791．303±0．065

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.3 EsA含藥血清對(duì)p-ERK1/2蛋白的表達(dá)的影響 同空白對(duì)照組(0.85±0.10)相比，IL-1β單獨(dú)作用組的中p-ERK1/2表達(dá)量(1.06±0.04)最高(P<0.05)，其余各觀察組與IL-1β組相比，IL-1β+EsA雙重作用組(0.90±0.02)、IL-1β+U0126雙重作用組(0.90±0.05)、IL-1β+U0126+EsA共同作用組(0.87±0.06)中p-ERK1/2表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.4 EsA含藥血清對(duì)AP-1蛋白的表達(dá) IL-1β單獨(dú)作用組中AP-1的表達(dá)量(1.38±0.02)最高，同空白對(duì)照組(0.49±0.02)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-1β+EsA雙重作用組(0.48±0.02)、IL-1β+U0126雙重作用組(0.82±0.02)、IL-1β+U0126+EsA共同作用組(0.47±0.03)與IL-1β單獨(dú)作用組相比，表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

EsA是源自一種名為商陸的植物根部提純所得的三萜類皂苷化合物，長(zhǎng)期以來多向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)相關(guān)研究充分證實(shí)了該種藥物在抗炎方面所具備的獨(dú)特效應(yīng)。二十一世紀(jì)開始我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展受到國(guó)家高度重視，大量中藥臨床研究發(fā)現(xiàn)許多的中藥對(duì)于慢性腎臟疾病有良好治療效果，并能夠逆轉(zhuǎn)慢性腎臟疾病的病理生理過程。其中，對(duì)于EsA的研究過程中其高效的抗慢性腎臟疾病作用的效果令人驚喜，然而其具體的作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

血清藥理學(xué)研究原理即通過向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物胃內(nèi)灌注待研究藥物的方法，使藥物在動(dòng)物體內(nèi)維持一定濃度后，通過收集動(dòng)物血液進(jìn)而分離出含有研究藥物的血清，將所得到的血清作用于模擬機(jī)體內(nèi)環(huán)境下體外培養(yǎng)的靶細(xì)胞，觀察靶細(xì)胞在藥物作用下的生長(zhǎng)、增值及凋亡等狀態(tài)，經(jīng)過分析得出結(jié)論，研究過程科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)，實(shí)驗(yàn)過程接近體內(nèi)環(huán)境，結(jié)果可信度高[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)曉多等[13]利用LC-IT-MS/MS法對(duì)按15 mg/kg EsA進(jìn)行胃內(nèi)灌注的大鼠所提取的血清進(jìn)行分析未檢測(cè)出任何內(nèi)源性干擾物質(zhì)存在，說明了EsA經(jīng)胃灌注采集到的動(dòng)物血清有效成分確定性。本次研究發(fā)現(xiàn)：按照5～10 mg/kg EsA進(jìn)行胃內(nèi)灌注所得血清作用rGMC在24～72 h后細(xì)胞的增殖受到顯著抑制(P<0.05或P<0.01)。另外，本課題研究組之前研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)EsA非含藥血清作用于體外培養(yǎng)的rGMC，同樣可顯著抑制其增殖[3]，而且大鼠在經(jīng)過EsA灌胃之后其血清中商陸EsA藥效穩(wěn)定[13]，因此可以推斷EsA在體內(nèi)達(dá)到一定濃度之后將對(duì)rGMC的增殖起到直接的抑制作用。

IL-1β被大量的研究證實(shí)在人體中作為一種關(guān)鍵的炎性因子存在，它能夠引起靶細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì)，對(duì)自身和周圍細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，許多學(xué)者提出IL-1β在刺激GMC增殖、引起細(xì)胞外基質(zhì)的分泌等一系列病理生理發(fā)生、發(fā)展的過程中扮演著重要角色。分子生物學(xué)研究證實(shí)了IL-1β生物作用的發(fā)揮經(jīng)過MAPK通路及核轉(zhuǎn)錄因子-ΚB信號(hào)通路起作用[14]。而ERK作為MAPK家族中功能最為廣泛的成員，由ERKl、ERK2兩個(gè)高度同源的亞類組成，ERK1/2基因指導(dǎo)了此兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量分別為44×103、42×103的蛋白質(zhì)的具體編碼[15]。ERKl/2主要定位于細(xì)胞漿，一定病理作用因素下將轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而引起其作用的下游基因的激活，發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過程的生物學(xué)效應(yīng)[16]。U0126作為ERK1/2信號(hào)通路中特異性最高的ATP非競(jìng)爭(zhēng)性ERK抑制劑，能夠即時(shí)有效地阻斷ERK信號(hào)通路的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的GMC增殖過程中，p-ERK1/2表達(dá)上調(diào)；Ang-(1-7)抑制GMC增殖，p-ERK1/2入核過程中斷，使促細(xì)胞增殖因子的表達(dá)量降低，GMC增殖過程得到阻斷或逆轉(zhuǎn)[17]。AP-1也是一種可指導(dǎo)細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在外界相關(guān)因子作用下引起一些細(xì)胞核內(nèi)增殖相關(guān)信號(hào)通路的激活。AP-1屬于MAPKs的亞型-ERK1/2、JUK、P38的共同作用底物之一。ERK1/2可使AP-1的C-Jun的絲氨酸Ser73位點(diǎn)磷酸化，因此AP-1為ERK1/2通路中重要的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。已知MCP-1、IL-1β、FN、LN等基因啟動(dòng)子中均存在與AP-1接合的作用元件(TRE元件)，在細(xì)胞增生、分化、凋亡及EMC(FN、LN、ColⅣ等)積聚中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，LPS、IL-1β、ET-1和AngⅡ等均可活化GMC中的AP-1，而下調(diào)AP-1活性可抑制GMC增殖[18-19]。因此AP-1的活化參與調(diào)控了IL-1β等誘導(dǎo)的GMC的增殖及EMC積聚。本研究中P-ERK、AP-1檢測(cè)結(jié)果顯示：IL-1β作用下rGMC內(nèi)p-ERK1/2、AP-1基因表達(dá)均顯著提高，使ERK1/2-AP-1通路活化，引發(fā)了細(xì)胞的增殖。EsA、U0126及EsA聯(lián)合U016作用下，檢測(cè)結(jié)果顯示rGMC內(nèi)p-ERK1/2、AP-1蛋白水平降低，提示其基因表達(dá)受阻，然而此三者間p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異并不顯著，分析原因可能與培養(yǎng)的GMC增殖的速度、檢測(cè)指標(biāo)的時(shí)間點(diǎn)及藥物的時(shí)效、藥物間空間構(gòu)象作用效應(yīng)減弱等因素有關(guān)，同時(shí)從蛋白質(zhì)水平提示了U0126沒有促進(jìn)EsA阻斷ERK通路的作用。針對(duì)AP-1表達(dá)，IL-1β+U0126組明顯高于IL-1β+EsA組及IL-1β+U0126+EsA組，可能為U0126特異性抑制了ERK1/2通路，下調(diào)了AP-1表達(dá)，而EsA除阻斷ERK1/2通路外，尚可能阻斷了其他AP-1的上游通路，致AP-1進(jìn)一步減少，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本次研究充分證實(shí)了GMC可能為EsA在腎組織中直接作用的靶細(xì)胞，EsA用藥后將有效抑制ERK1/2-AP-1通路，抑制p-ERK1/2、AP-1的表達(dá)，從而抑制了系膜細(xì)胞的增殖過程，進(jìn)而慢性腎臟疾病的病理生理過程也將得到有效逆轉(zhuǎn)。

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Influence of esculentoside A on activation of ERK1/2-AP-1 pathway of glomerular mesangial cell induced by IL-1β*

TangJieyin,DongYang,ZhangXianggui△,XiaoHan,ZhangWei,XuLijun

(DepartmentofNephrology,FifthAffiliatedHospital(Zhuhai)ofZunyiMedicalCollege,Zhuhai,Guangdong519100,China)

Objective To observe the influence of serum containing esculentoside A(EsA) on the proliferation of glomerular mesangial cell (GMC) and the activation of ERK1/2-AP-1 pathway of glomerular mesangial cell induced by IL-1β.Methods SD rats were gavaged by different doses of EsA(5,10,20,40 mg/kg) for getting medicated sera.The control group was set (gavage by 0.5sodium carboxymethylcellulose);the EsA medicated serum was used to treat rGMC.The control serum group was set.The influence of EsA medicated serum in each group on rGMC proliferation was detected by MTT;the rGMC was divided into the blank control group,IL-1β single action group,IL-1β+EsA double action group,IL-1β+U016 double action group and IL-1β+U0126+EsA combined action group,which were synchronized and then cultured for 48 h.Western blot was used to detect the expression of p-ERK1/2 and AP-1 an the imaging analysis was performed.Results The EsA medicated serum(5-10 mg/kg gavage) inhibited the cellular proliferation(P<0.05 orP<0.01);the IL-1β group promoted the expression of p-ERK1/2 and AP-1 in rGMC(P<0.05),after acting on rGMC in the IL-1β+EsA double action group,IL-1β+U0126 double action group and IL-1β+U0126+EsA combined action group,the expression of p-ERK1/2 and AP-1 was decreased(P<0.05).Conclusion Serum containing EsA (5～10 mg/kg gavage) significantly inhibits the rGMC proliferation;EsA inhibits IL-1β induced rGMC proliferation,its action pathway on ERK1/2-AP-1 is one of mechanisms for inhibiting rGMC proliferation.

Esculentoside A;cell proliferation;glomerular mesangial cell;AP-1;ERK1/2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.007

廣東省珠海市醫(yī)學(xué)科研課題(2014067)。 作者簡(jiǎn)介：湯杰印(1975-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性腎臟病臨床及基礎(chǔ)研究。△

，E-mil:zxg5220@163.com。

R285

A

1671-8348(2017)16-2183-04

2017-01-08

2017-03-12)