韓國英，劉剛，王興業(yè)，王茂超，郭海巖，曹瑞兵，劉曉東,3

(1. 山東仙普愛瑞科技股份，山東高密 261500；2. 南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部 動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095； 3. 青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 預防獸醫(yī)學山東省重點實驗，青島 266000)

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重組豬α-干擾素噴干粉劑的制備及其效果評價

韓國英1，劉剛1，王興業(yè)1，王茂超1，郭海巖1，曹瑞兵2，劉曉東1,3

(1. 山東仙普愛瑞科技股份，山東高密 261500；2. 南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部 動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095； 3. 青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 預防獸醫(yī)學山東省重點實驗，青島 266000)

為制備一種高活性、低價格重組豬α-干擾素(PoIFN-α)，采用噴霧干燥技術制備出重組豬α-干擾素(rPoIFN-α)噴干粉劑，并通過對rPoIFN-α噴干粉劑的穩(wěn)定性，安全性，治療效果等質(zhì)量標準進行綜合評價。結(jié)果顯示，本試驗制備的重組豬α-干擾素噴干粉劑質(zhì)量穩(wěn)定性，有效期暫定為兩年；除10倍劑量rPoIFN-α噴干粉劑導致豬肝臟輕微脂肪樣病變，其余各較低劑量rPoIFN-α噴干粉劑對豬無毒副作用；人工感染和臨床應用試驗表明rPoIFN-α噴干粉劑對豬腹瀉具有顯著的治療效果，為PoIFN-α噴干粉劑的工程化生產(chǎn)及其在養(yǎng)豬業(yè)中的應用提供參考。

重組豬α干擾素噴干粉劑；噴霧干燥技術；豬腹瀉

豬α-干擾素(porcine interferon α, poIFN-α)屬于 Ⅰ 型干擾素，有17個基因亞型，分別定位于豬1號染色體上，目前已全部被克隆測序[1-2]。目前，豬α-干擾素在大腸桿菌[3-4]、畢赤酵母[5]和動物細胞[6]等表達系統(tǒng)中均實現(xiàn)了表達。重組豬α-干擾素(recombinant porcine interferon α, rpoIFN-α)蛋白活性分析表明其對口蹄疫病毒[7]、豬呼吸與繁殖綜合征病毒[8-9]、傳染性胃腸炎病毒[10]和豬偽狂犬病病毒[11]等均具有抑制作用，并與多種抗原配伍免疫具有免疫佐劑功能[12-14]。因此，作為廣譜抗病毒藥可用于豬病毒性疾病的防治。

近年來，豬α-干擾素常用的產(chǎn)品劑型有液態(tài)制劑和凍干制劑[15]。液態(tài)制劑存在熱穩(wěn)定性差，不易長期保存和遠距離運輸?shù)葐栴}；凍干制劑存在產(chǎn)量低，成本高和制作工藝復雜難以規(guī)?；葐栴}，均限制了豬干擾素在豬病毒性疾病治療中的推廣和應用[15]。本研究選擇相對經(jīng)濟而又技術先進的噴霧干燥法將重組豬α-干擾素液態(tài)制劑制成噴干粉制劑，實現(xiàn)了豬重組豬α-干擾素低成本規(guī)模化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株、病毒、細胞和試劑 重組poIFN-α畢赤酵母菌株為青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院預防獸醫(yī)學山東省重點實驗室提供；牛腎細胞(MDBK)購自中國科學院細胞庫；水泡性口炎病毒(VSV)和豬流行性腹瀉病毒(PED)為本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司；重組豬α-干擾素凍干制劑按照專利[16]方法制備；血常規(guī)及血液生化指標測定試劑購自四川省邁克科技有限責任公司生產(chǎn)；Sephacryl S-100購自上海安瀾德生物科技有限公司；人α干擾素標準品購自中國藥品生物制品檢定所；其他化學試劑均為分析純。

1.1.2 試驗動物 30日齡健康二元雜交豬，健康1日齡未吃初乳二元雜交仔豬，購自山東萊州市厚德豬食品有限公司豬場。

1.2 主要試驗設備 GQ-105型管式離心機購自遼陽隆達制藥機械有限公司。陶瓷膜設備購自安徽普朗膜技術有限公司。LPG150噴霧干燥機購自無錫市能達干燥設備有限公司。MEK-6138K全自動血液學分析儀購自日本光電工業(yè)株式會社生產(chǎn)；魅力1800自動血液生化分析儀購自美國MD儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組豬α-干擾素噴干粉劑的制備工藝 將儲料罐內(nèi)的發(fā)酵液進行離心，轉(zhuǎn)速為12000 rpm，處理量為1.2 m3/h；離心后，將上清液通過30 kDa陶瓷膜過濾，控制進口壓力為0.5 MPa，出口壓力0.2 MPa，上清液的溫度和流速分別為：40 ℃和1 m3/h，收集透過液；透過液用0.5 mol/L Na2HPO4調(diào)至pH 7.0左右，采用直徑1 m，高4 m不銹鋼柱，Sephacryl S-100凝膠，裝柱量為75 %，S-100柱用PBS平衡3倍柱床體積，上樣收集目標蛋白液；純化得到的蛋白樣品液通過10 kDa陶瓷膜過濾脫鹽；在濃縮液中加入賦形劑10%海藻糖、保護劑6%大豆卵磷脂后，以1000 rpm攪拌20 min，得到噴干液；最終將噴干液進行噴霧干燥，控制噴霧干燥機的進口溫度為110 ℃，出口溫度為70 ℃，噴液速度為200 L/h，得到重組豬α-干擾素噴干粉劑。

1.3.2 重組豬α-干擾素噴干粉劑的活性測定 采用細胞病變抑制法，以MDBK-VSV為檢測系統(tǒng)，采用人α干擾素標準品校準為IU。

1.3.3 采用正交試驗確定賦形劑與保護劑的種類和添加量 選賦形劑的種類，保護劑的種類，賦形劑的添加量，保護劑的添加量四個主要影響因素，按照L16(45)正交試驗設計優(yōu)化參數(shù)，正交試驗因素與水平設計見表1。

1.3.4 噴干后放置40 ℃加速穩(wěn)定性試驗 根據(jù)文獻[17]中的方法，將噴干后重組豬α-干擾素放置40 ℃加速穩(wěn)定性試驗。每個月定期采樣進行活性檢測。

1.3.5 重組豬α-干擾素噴干粉劑對豬安全性試驗

取健康仔豬20只，隨機分為4組(3組試驗組和1組對照組)，每組5頭，第1～3組分別灌服重組豬α-干擾素10 mL，分為低0.05 g/mL、中0.25 g/mL、高0.5 g/mL三種劑量(即1倍劑量，5倍劑量和10倍劑量)，連續(xù)灌服7 d，對照組，灌服生理鹽水10 mL。

表1 正交試驗因素水平表Tab 1 Factors and levels used for orthogonal test

從灌服重組豬α-干擾素前及灌服后的第一天起，對仔豬體重、體溫、飲水、眼瞼指征、呼吸指征、運動指征、皮膚、糞便、血常規(guī)及血液生化指標等方面進行觀察檢測，灌服后連續(xù)觀察14 d。試驗結(jié)束時剖檢仔豬，觀察腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官及消化道有無病理變化。病變組織，按1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大小取材，立即用10 %甲醛固定，石蠟包埋后HE染色進行病理學檢查。

1.3.6 重組豬α-干擾素噴干粉劑的實驗室治療試驗 將30 頭剛出生未吃初乳的仔豬隨機分成3組，每組10頭，第1組為試驗組，即重組豬α-干擾素噴干粉劑治療組；第2組為對照組，即重組豬α-干擾素凍干粉劑治療組；第3組為空白對照組，即未進行治療組。各組仔豬注射器灌服2 mL PED病毒液(病毒濃度為1×106TCID50/mL)，一天2次。當仔豬開始出現(xiàn)腹瀉癥狀時，試驗組仔豬灌服重組豬α-干擾素噴干粉劑，每次用量0.5 g，用生理鹽水稀釋成5 mL，每天1次；對照組仔豬灌服同等劑量重組豬α-干擾素凍干粉劑，每天1次；空白對照組仔豬灌服同等劑量生理鹽水5 mL。觀察治療效果，統(tǒng)計發(fā)病及死亡情況。

1.3.7 重組豬α-干擾素噴干粉劑的臨床應用

萊州市厚德豬食品有限公司豬場仔豬腹瀉屢有發(fā)生，取相同日齡病豬110頭，試驗組取10日齡病仔豬50頭灌服重組豬α-干擾素噴干粉劑，每次用量0.5 g，用生理鹽水稀釋成5 mL，每天1次；對照組取50頭仔豬灌服同等劑量重組豬α-干擾素凍干粉劑，每天1次；空白對照組取病10頭仔豬灌服生理鹽水5 mL。記錄干擾素治療后的痊愈與死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組豬α-干擾素噴干粉劑效價的測定 重組豬α-干擾素在MDBK-VSV系統(tǒng)中抗病毒活性為2.2×106IU/mL。噴霧干燥后，干擾素在MDBK-VSV系統(tǒng)中抗病毒活性為1.74×106IU/mL，噴霧干燥后與噴霧干燥前的活性比為79 %。由此可見，重組豬α-干擾素作為一種高活性蛋白在該干燥過程中的穩(wěn)定性易于遭受破壞。

2.2 正交試驗設計結(jié)果與分析 由表2可知，極差大小順序為C>D>B>A，可以看出保護劑的種類是影響干擾素干粉劑穩(wěn)定性的主要因素，其次是保護劑賦形劑的濃度，賦形劑的種類對重組豬α-干擾素噴干粉劑穩(wěn)定性的影響相對較小，由正交試驗結(jié)果得到的最佳工藝組合是A2B1C4D4，即：賦形劑的種類麥芽糊精，添加量20 %，保護劑的種類聚乙二醇20000，添加量1 %。

采用優(yōu)化后的參數(shù)進行噴霧，重復三次試驗，噴霧干燥后與噴霧干燥前的活性比維持在100±1.5 %，可有效保證重組豬α-干擾素的活性。

2.3 重組豬α-干擾素噴干粉劑40 ℃加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果 由表3可知，樣品放置了三個月后，活性穩(wěn)定，并無顯著性差異(P>0.05)，則有效期可暫定為兩年。

2.4 重組豬α-干擾素噴干粉劑對豬安全性試驗結(jié)果 在試驗中，各組豬均無死亡，行為特征灌服藥物前后無變化。體重檢測中各試驗組豬與對照組相似，均無顯著差異(P>0.05)(表4)。與給藥前相比，體溫變化與對照組相似，即各組仔豬體溫都在38.5～39.5 ℃內(nèi)波動，與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)(表4)。

表2 正交試驗結(jié)果與分析Tab 2 Results of orthogonal test

表3 重組豬α-噴干粉劑的穩(wěn)定性試驗Tab 3 Stability test of rpoIFN-α spray dried powder

表4 重組豬α-干擾素噴干粉劑對豬體重和體溫的影響Tab 4 Effects of ingesting rpoIFN-α spray dried powder on weight and body temperature of swine

血液常規(guī)結(jié)果見表5。在整個試驗期間內(nèi)，各組別豬在不同時間點采集的血液所測定的各項指標均在正常參考范圍之內(nèi)。且1、5和10倍劑量組與空白對照組相比，并無顯著性差異(P>0.05)。因此干擾素干粉劑在0.5～5 g劑量范圍對血液常規(guī)指標無明顯的影響。

表5 重組豬α-干擾素噴干粉劑對豬血常規(guī)的影響Tab 5 Effect to blood routine after medication in swine

WBC(白細胞)，RBC(紅細胞)，PLT(血小板)，MCV(平均紅細胞容積)，HGB(血紅蛋白)，HCT(紅細胞壓積)。

WBC means white blood cell, RBC means red blood cell, PLT means blood platelet, MCV means Mean corpuscular volume, HGB means haemoglobin, HCT means hematocrit.

血清生化檢測結(jié)果見表6，1倍和5倍劑量組的GOT、BUN、CREA、GPT、ALP和ALB的平均值與對照組的平均值均無顯著差異，GOT為心臟功能指標；BUN、CREA是腎功能的重要指標。GPT、ALP、ALB為常用的肝功能檢測指標，故認為1倍和5倍劑量組對豬的腎、心臟和肝臟功能無損害；解剖后經(jīng)肉眼觀察，1倍和5倍劑量組較對照組仔豬的腦、心臟、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟等器官及消化道均未出現(xiàn)明顯的病理變化。

在10倍劑量組較對照組除GPT、ALP、T-CHO水平均升高，ALB水平降低，差異均顯著(P<0.05)，說明肝臟在高劑量組存在損傷。HE染色可知：對照組豬肝索排列整齊，肝細胞大小均勻，無變性壞死；10倍劑量組豬肝臟肝板排列紊亂，肝細胞輕微脂肪變性(圖1)。

表6 重組豬α-干擾素對豬血清生化指標的影響Tab 6 Effect on serum parameters after medication in swine

*表示差異顯著P<0.05。CREA(肌酐)，GLU(血糖)，GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)，ALB(白蛋白)，BUN(血清尿素氮)，ALP(堿性磷酸酶)，GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)，T-CHO(總膽固醇)。

*means significant difference (P<0.05). CREA means creatinine, GLU means glucose, GOT means glutamic oxalacetic transaminase, ALB means albumin, BUN means blood urea nitrogen, ALP means alkaline phosphatase, GPT means glutamate pyruvate transaminase T-CHO means total cholesterol.

A. 對照組；B. 10倍劑量組A. Control group; B. 10-fold dose圖1 各劑量組的肝臟組織切片(HE染色，×20)Fig 1 Livers change in different dosage of rpoIFN-α spray dried powder

2.5 重組豬α-干擾素噴干粉劑的實驗室治療結(jié)果

攻毒后12～24 h，所有仔豬均出現(xiàn)腹瀉癥狀。試驗組在豬灌服重組豬α-干擾素噴干粉劑后腹瀉癥狀逐漸減輕，2～3 d后全部恢復正常；灌服重組豬α-干擾素凍干粉劑治療對照組，腹瀉癥狀減輕和恢復程度與試驗組一致；未采取治療措施的空白對照組則全部死亡，死亡率為100 %，結(jié)果見表7。

2.6 α-干擾素干粉劑的臨床應用結(jié)果 對臨床上仔豬腹瀉的病豬，試驗組在豬灌服重組豬α-干擾素噴干粉劑后，1 d后腹瀉癥狀逐漸減輕，3 d后全部恢復正常，50例病豬中，治愈46例，治愈率為92 %；灌服重組豬α-干擾素凍干粉劑治療對照組，腹瀉癥狀減輕和恢復程度與試驗組一致，差異不顯著；未采取治療措施的空白對照組則全部死亡，死亡率為100 %，結(jié)果見表8。

表7 重組豬α-干擾素噴干粉劑的實驗室治療結(jié)果Tab 7 Therapeutic efficacy of rpoIFN-α spray dried powder

表8 重組豬α-干擾素噴干粉劑的臨床應用結(jié)果Tab 8 Clinical application of rpoIFN-α spray dried powder

3 討論與小結(jié)

病毒性疫病已成為我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病，嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。對于病毒性疫病，豬干擾素等生物制劑是目前市場上治療的首選藥物。當前市場應用的豬干擾素以凍干制劑為主，但由于冷凍干燥技術上的缺陷，使其存在成本高和成品價格昂貴等問題。本研究選擇噴霧干燥技術將重組豬α-干擾素液態(tài)制劑制成噴干粉制劑，與凍干制劑相比在成本可以節(jié)省71.4 %～80.6 %，使其成品價格大大降低，易于基層養(yǎng)殖者的接受，為豬α-干擾素的普及應用奠定了基礎。

基于蛋白、多肽類物質(zhì)的性質(zhì)，噴霧干燥過程中的一些因素，如噴嘴的剪切力、液滴干燥時產(chǎn)生的熱應力、蛋白或多肽在空氣-液體界面的吸附等都會對這些物質(zhì)的活性造成一定的破壞，為此要添加賦形劑和保護劑減少對成品的活性損傷[18-19]。本研究通過優(yōu)化賦形劑和保護劑的種類和濃度使重組豬α-干擾素在噴霧干燥過程中的穩(wěn)定性可以大大提高，噴霧干燥后與噴霧干燥前重組豬α-干擾素的活性比維持在100±1.5 %，有效期為2年以上。

豬α-干擾素是一種分泌蛋白，分泌蛋白在體內(nèi)的半衰期很短，若要達到治療水平，必須持續(xù)大劑量使用，有可能會產(chǎn)生一些副作用，進行重組豬α-干擾素噴干粉劑對豬的安全性試驗研究非常必要。本試驗結(jié)果表明，1倍和5倍劑量重組豬α-干擾素噴干粉劑的使用均對靶動物無明顯毒性反應。10倍劑量組中豬肝臟產(chǎn)生輕微的脂肪樣變，這與蔣佳穎[20]等人研究一致，推測可能由于高劑量的干擾素使肝臟功能受到不同程度的損傷，導致肝細胞壞死后產(chǎn)生脂肪樣變。由此說明重組豬α-干擾素噴干粉劑的每次使用劑量低于2.5 g，對靶動物無毒副作用，具有良好的臨床應用前景。

腹瀉是豬的一種常見病，它不僅影響豬的正常生長發(fā)育，引起較高的死亡率，給廣大養(yǎng)殖者帶來嚴重的經(jīng)濟損失；而且該病會給畜產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康帶來隱患。本試驗仔豬人工感染治療試驗和臨床應用結(jié)果表明感染仔豬灌服重組豬α-干擾素獲得了有效的保護，降低了死亡率，這與陳國華[21]等人研究成果一致；并且重組豬α-干擾素噴干粉劑與凍干粉劑的治療效果無顯著差異，說明重組豬α-干擾素噴干粉劑具有明顯的抗病毒活性，可以作為新型豬α-干擾素制劑應用于豬腹瀉的治療。

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(編輯：陳希)

Preparation and Effect Evaluation of Recombinant Porcine Interferon Alpha Spray Dried Powder

HAN Guo-ying1, LIU Gang1, WANG Xing-ye1, WANG Mao-chao1, CAO Rui-bing2, LIU Xiao-dong1,3

(1.ShandongXianpuairuiScienceandTechnologyCompanyLimited,Gaomi,Shandong261500,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseDiagnosisandImmunology,MinistryofAgriculture,NanjingAgricultureUniversity,Nanjing210095,China; 3.ShandongKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266000,China)

To prepare high-activity and low-price recombinant porcine interferon alpha(PoIFN-α), the recombinant porcine interferon alpha(rPoIFN-α)spray powder was prepared by spray drying technology, and its stability, safety and treatment effect were studied in detail, respectively. The results showed the rPoIFN-α spray powder had distinct quality advantages in stability, suggesting that expiration time of the spray-drying rPoIFN-α preparation was 24 months; 5-fold dose/only the following does did not produce any toxic effect on swine, whereas, 10-fold dose could lead to mild fatty degeneration in swines' livers cells; The cure rate of artificially infected and clinical treatment showed rPoIFN-α spray powder had obvious curative effect against diarrhea. This study will pave the way for the production of the engineered porcine interferon in the large scale and their application in pig farming industry.

recombinant porcine interferon alpha spray powder; spray drying technology; diarrhea

韓國英，碩士研究生，從事生物制藥方面研究。E-mail: hanguoying_1@126.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.05

2016-12-09

A

1002-1280 (2017) 06-0033-08

S859.79