黃繼紅 周學(xué)軍

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 ?？?570102)

老年鼻咽癌患者血漿Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因、血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1及乳鐵蛋白的表達及相關(guān)性

黃繼紅 周學(xué)軍

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，海南 海口 570102)

目的 探討血漿Ras相關(guān)區(qū)域家族(RASSF)1A基因、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1及乳鐵蛋白(LTF)在老年鼻咽癌(NPC)患者及其不同臨床病理特征中的表達及相關(guān)性。方法 NPC患者50例為NPC組，鼻咽炎患者50例為鼻咽炎組，健康志愿者50例為正常對照組。3組采用定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(RQ-MSP)檢測RASSF1A基因、血清TGF-β1及LTF的表達情況，并分析相關(guān)性。結(jié)果 NPC組血漿中RASSF1A、TGF-β1及LTF的表達與鼻咽炎組、正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NPC組血漿RASSF1A、TGF-β1及LTF水平：Ⅰ期與其他期差異顯著(P<0.01)；Ⅲ期與Ⅳa期、Ⅳb期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未分化癌與鱗癌、腺癌差異顯著(P<0.01)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，頸部和遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 RASSF1A、TGF-β1及LTF在老年鼻咽癌患者血清中表達呈上調(diào)或下降趨勢，與鼻咽癌分期、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

鼻咽癌；Ras相關(guān)區(qū)域家族(RASSF)1A；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1；乳鐵蛋白(LTF)

鼻咽癌(NPC)的發(fā)病占頭頸部惡性腫瘤的50% 以上，占鼻咽部惡性腫瘤的90%，早期NPC規(guī)范治療后5年生存率61.13%～73.19%，晚期僅15.14%～23.16%〔1〕。治療前后隨時可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，NPC治療失敗是患者死亡的主要原因(占45%～60%)〔2,3〕。如何早診斷早治療及評定預(yù)后，則成為NPC治療的關(guān)鍵。在人類多種惡性腫瘤和細胞株中，Ras相關(guān)區(qū)域家族(RASSF)1A基因發(fā)生突變的情況很少，但它與Ras的效應(yīng)基因?qū)儆谕椿颉Ｓ醒芯勘砻鬓D(zhuǎn)染RASSF1A基因可使肺癌細胞株克隆形成率降低，這說明RASSF1A可能抑制腫瘤細胞生長。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一種具有多種功能的細胞因子,在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔4〕。乳鐵蛋白(LTF)是一種分泌性糖蛋白，一些體內(nèi)外實驗都有證實LTF存在多種生物學(xué)功能，如參與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等〔5〕。本文探討老年NPC患者血漿RASSF1A基因、血清TGF-β1及LTF表達及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年2月至2015年12月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年NPC患者50例，入院前均未行化療或放療，臨床資料完整，其中男31例,女19例，年齡60～85歲,平均(75.6±10.8)歲,均符合《實用腫瘤內(nèi)科學(xué)》鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤治療學(xué)分會2008年制定的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)〔3〕，健康志愿者50例為正常對照組，其中男26例,女24例，年齡61～81歲,平均(77.6±11.8)歲。鼻咽炎患者50例作為鼻咽炎組，其中男38例,女12例，年齡60～86歲,平均(76.3±9.9)歲。三組年齡、性別均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。均簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 主要試劑及方法 RASSF1A、TGF-β1及LTF提取試劑盒均購自海南一鼎生物制劑有限公司，按照說明書操作，進行定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(RQ-MSP)法檢測。均于消毒條件下，抽取靜脈血10 ml，置于消毒試管中，低溫離心機離心10 min(1 500 r/min)，提取上清液置入Eppendorf管中，置-80℃冰箱中保存待測。引物設(shè)計：由Primer 5.0 引物設(shè)計軟件設(shè)計。RASSF1A基因上游引物：5′-TGCGGGCATGGTTACTGC-3′，下游引物：5′-GAGGGCTTCCTGGACACG-3′，擴增片段長度為197 bp；TGF-β1基因上游引物：5′-TGACCTGTTCCAAAGAGTCCCTG-3′，下游引物：5′-GCAGCTTCCAGCACATATCGACT-3′，其擴增目的片段為486 bp；LTF基因上游引物：5′-CCCAAGCTTGATCCCAGAACCATGAACC-3′，下游引物：5′-AGCGGATCCACCAGTCACAGGGACAT-3′。 三種基因引物均由introvigen公司合成。血漿中DNA的提?。河肗ANODROP 2000c(Thermo)法參照QIAamp UltraSens Virus Kit說明書檢測DNA含量，其完整性通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測。mRNA的提取：可用0.5 ml Trizol(Invitrogen,VSA)，振蕩；100 μl氯仿，劇烈振蕩，分層靜置，12 000 r/min臺式離心機離心10 min；取80%上清液，加500 μl異丙醇，沉淀總RNA，12 000 r/min離心機離心5 min，棄上清液，加1 ml 75%冰乙醇洗滌，12 000 r/min離心機離心5 min，棄上清液，空氣中干燥30 min，加20～50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的消毒三蒸水，溶解，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、線性回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF的表達 3組RASSF1A、LTF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),NPC組TGF-β1明顯高于鼻咽炎組和正常對照組(P<0.01)。見表1。

表1 3組血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF水平的比較

與鼻咽炎組、正常對照組比較：1)P<0.01

2.2 RASSF1A、TGF-β1及LTF的表達與臨床病理特征的關(guān)系 血清中RASSF1A、TGF-β1及LTF表達：Ⅰ期與其他期差異顯著(P<0.01)；Ⅲ期與Ⅳa期、Ⅳb期均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。未分化癌與鱗癌、腺癌差異顯著(P<0.01)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，頸部、遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 RASSF1A、TGF-β1及LTF的表達與NPC患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

1)與Ⅰ期比較，2)與Ⅲ期比較，3)與未分化癌比較，4)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較：均P<0.01；5)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較：P<0.05

3 討 論

NPC在中國華南地區(qū)是高發(fā)地區(qū)，其早期臨床表現(xiàn)與鼻咽炎相似，易誤診。早期診斷方面主要包括臨床診斷、影像學(xué)的檢查、EB病毒檢查〔6〕，最后才是鼻咽活組織檢查，病理組織學(xué)診斷是NPC確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于經(jīng)濟原因和患者自身的忽視，同時早期病變較小， 所在部位隱蔽，因此，就診時大部分患者已處于中晚期〔7〕，甚至已經(jīng)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，尤其是在老年人群中其病死率較高。雖然RASSF1A的表達與NPC的分期及分類均無顯著差異，但隨著NPC發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移或是分期延后，其表達都存在下降，提示RASSF1A基因表達下調(diào)可能是NPC發(fā)病的后期事件〔8,9〕。TGF-β1 廣泛存在于正?；虬┳兘M織中,參與細胞增殖、分化、凋亡等過程,使上皮細胞運動和侵襲能力增強,并促進腫瘤血管生成〔10〕，Hu等〔11〕證實TGF-β1 能豐富血管，不僅增加了腫瘤細胞進入血液循環(huán)的機會,而且也促進淋巴道轉(zhuǎn)移。細胞角蛋白19可以有效反映腫瘤細胞的活性，是腫瘤診斷、 療效監(jiān)控和復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標(biāo)之一〔5〕。腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，需要豐富的營養(yǎng)，即再生大量的血管，同時也必須使腫瘤細胞有活性，從而呈現(xiàn)一種強烈的應(yīng)激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)LFT表達下調(diào)，推測在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后都與RASSF1A、TGF-β1及LTF參與相關(guān)，并且其在不同時期都發(fā)揮重要作用。

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〔2017-01-29修回〕

(編輯 苑云杰)

海南省衛(wèi)生廳科研項目(No.瓊衛(wèi)2012PT-29)

周學(xué)軍(1968-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科疾病研究。

黃繼紅(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事鼻咽癌腫瘤研究。

R766.3

A

1005-9202(2017)13-3235-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.051