鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建 福州 350001)

銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制

鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建 福州 350001)

目的 探討銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的作用及其可能的抗氧化機(jī)制。方法 30只Wistar 雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、銀杏葉藥物組(GBE組)，每組10只，銀杏葉灌胃1 w后制備心肌缺血模型。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠形態(tài)學(xué)改變；心肌梗死面積利用TTC染色測定；根據(jù)試劑盒說明測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。結(jié)果 Sham組可見心肌細(xì)胞排列整齊，各結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核均勻分布；模型組部分心肌細(xì)胞壞死，細(xì)胞之間界限欠清，細(xì)胞水腫，排列紊亂；GBE組細(xì)胞小部分結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞界限尚清晰，輕度水腫。GBE組大鼠心肌梗死面積明顯低于I/R組。同時，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著低于Sham組，MDA水平高于I/R組(均P<0.05)，GBE組血清SOD、GSH-Px含量明顯高于I/R組，MDA水平低于I/R組(P<0.05)。結(jié)論 GBE對大鼠MIRI具有明顯的保護(hù)作用，其可能與抑制氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

銀杏葉提取物；心肌缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)在血流恢復(fù)重建的再灌注過程加劇代謝紊亂，引起心肌超微結(jié)構(gòu)破壞的損傷過程〔1〕。關(guān)于MIRI的病理生理及機(jī)制較為復(fù)雜，包括氧自由基機(jī)制，炎癥反應(yīng)浸潤，能量代謝障礙、微血管通透性機(jī)制等。

銀杏葉提取物(GBE)是較為安全的草藥補(bǔ)充劑，研究表明其可明顯改善外周及腦的微循環(huán)〔2〕，甚至在MIRI過程中具有明顯的保護(hù)作用。目前標(biāo)準(zhǔn)化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內(nèi)酯和其他化學(xué)物質(zhì)〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護(hù)作用及其具可能的機(jī)制目前尚未研究，本文依據(jù)參考文獻(xiàn)建立大鼠MIRI模型，并利用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)來反映機(jī)體氧化還原水平，探討銀杏葉提取物對大鼠MIRI的作用及可能的抗氧化應(yīng)激機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性SD大鼠30只，體重(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥品、試劑及儀器 GBE購自中國藥品生物鑒定研究所(純度99%)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、伊文思藍(lán)、三苯基氯化四氮唑購于sigma公司；由TaKaRa大連寶生物有限公司提供Trizol試劑、熒光定量檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；由上海生工生物工程有限公司完成引物設(shè)計與合成。由廈門慧嘉生物有限公司提供SOD、MDA、GSH-Px試劑盒。

1.3 分組 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將30只健康Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)，缺血再管組(I/R組)，GBE組，每組10只。GBE組：造模前1 w給予0.5% GBE 50 mg/kg灌胃，而對Sham組及I/R組給予灌服0.5%CMC-Na 10 ml/kg。

1.4 MIRI模型制備 參考文獻(xiàn)〔4〕的方法建立MIRI模型。各組大鼠術(shù)前禁食6 h。對大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉(20%烏拉坦按8 ml/kg)，仰臥位固定，利用Medlab采集系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。正中切口切開頸部后氣管插管，并連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，選擇頻率65次/min，呼∶吸比為2∶1，選擇潮氣量為8 ml/kg。剪開胸部皮膚后暴露3～4肋間肌肉，剪斷第4肋骨，刺破胸膜進(jìn)入胸腔，暴露心臟，將心包膜剪開后將心臟擠出胸腔，結(jié)扎冠脈左前降支，造成急性心肌缺血模型。心電圖提示心率減慢，并出現(xiàn)寬大畸形的QRS波群，大鼠左室前壁出現(xiàn)充血、發(fā)紺，表示結(jié)扎成功。缺血30 min后給予恢復(fù)血流，心電圖提示QRS波群回落，提示再灌注成功。給予再灌注120 min。Sham組只穿線不結(jié)扎冠脈，其余操作均與余兩組相同。再灌注結(jié)束后，從腹主動脈取血，離心，凍存，進(jìn)行后期血清學(xué)檢測。

1.5 利用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定心肌梗死面積 再灌注結(jié)束時，注入2 ml 2%伊文藍(lán)向左心室，離體取標(biāo)本后凍存，橫向切片后，置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中浸泡，37℃條件下孵化染色20 min，4%多聚甲醛中固定，采用圖像分析軟件image-proplus6.0測定藍(lán)色、紅色、白色區(qū)域面積。藍(lán)紅白的面積之和為左心室面積(LV)，紅白之和為缺血面積(AAR)，白色面積為梗死面積(IS)。AAR百分比=AAR/LV；IS百分比=IS/AAR。

1.6 血清SOD、MDA含量的檢測 采用硫代巴比妥酸法測定血清中MDA 的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測SOD含量；采用二硫代二硝基甲苯胺法測定血中GSH-Px含量。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠形態(tài)學(xué)比較 Sham組可見心肌細(xì)胞排列整齊，各結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核均勻分布；I/R組部分心肌細(xì)胞壞死，細(xì)胞之間界限欠清，細(xì)胞水腫，排列紊亂；GBE組細(xì)胞小部分結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞界限尚清晰，輕度水腫。見圖1。I/R組、GBE組大鼠心肌梗死面積〔(22.130 5±2.023 9)%、(13.721 1±0.766 2)%〕，顯著高于Sham組(0%)，且GBE組低于I/R組(均P<0.01)。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA及GSH-Px水平比較 與Sham組比較，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著降低，MDA水平顯著增高，GBE組與I/R組比較，血清SOD、GSH-Px含量升高，MDA水平降低(均P<0.05)；GBE與Sham組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠心肌組織組織形態(tài)學(xué)比較(×400)

表1 各組大鼠血清SOD、MDA和 GSH-Px水平比較

與Sham組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05

3 討 論

目前關(guān)于MIRI的病理生理及機(jī)制較為復(fù)雜，包括氧自由基機(jī)制、炎癥反應(yīng)浸潤、能量代謝障礙、微血管通透性機(jī)制等。近來微血管通透機(jī)制方面成為研究熱點(diǎn)，成為預(yù)防MIRI損傷性疾病新的治療方向。

最近研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI過程，氧化應(yīng)激是心臟內(nèi)皮細(xì)胞障礙的主要原因，氧化應(yīng)激引起活性氧簇(ROS)增加，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，氧化蛋白質(zhì)失活及DNA損傷等〔5〕，同時亦可刺激下游信號通路誘導(dǎo)各種生物效應(yīng)，如促發(fā)凋亡、促發(fā)炎癥反應(yīng)等。既往體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)〔6〕，細(xì)胞低氧復(fù)氧后也有發(fā)生這一病理生理反應(yīng)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由ROS誘導(dǎo)的DNA損傷可以通過增加自身磷酸化激活毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白(ATM)激酶〔1〕，反過來觸發(fā)的磷酸化啟動后磷酸化p53基質(zhì)蛋白〔7～9〕。從而抑制氧化應(yīng)激的損傷。缺血再灌注激活了ROS相關(guān)的酶，從而激活腺嘌呤——次黃嘌呤代謝途徑，增加氧自由基的病理產(chǎn)生含量異常。而氧自由基對組成生物膜的不飽和脂肪酸具有很高的親和力，從而激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)等發(fā)生脂類過氧化反應(yīng)，引起線粒體酶活性降低，而細(xì)胞膜、溶酶體膜的通透性升高，引起細(xì)胞膨脹破裂。當(dāng)這一反應(yīng)遇到抗氧化物時，損傷效應(yīng)就會終止。MDA是一種在缺血再灌注損傷病理過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量高低可直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。而SOD是清除氧自由基的最主要物質(zhì)，其高低可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。GSH-Px可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，其活力大小可以反映機(jī)體氧化還原反應(yīng)。GBE是一種草藥補(bǔ)充劑，可明顯改善外周及腦的微循環(huán)，甚至在MIRI過程中，具有明顯的保護(hù)作用。目前標(biāo)準(zhǔn)化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內(nèi)酯和其他化學(xué)物質(zhì)〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞〔10～12〕。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護(hù)作用及其對機(jī)體抗氧化反應(yīng)目前尚未研究。本研究結(jié)果表明，GBE 761對大鼠MIRI具有明顯保護(hù)作用。血清學(xué)結(jié)果表明，GBE可明顯抑制大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并提高大鼠血清中SOD活性。

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〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吳黎明(1956-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心臟內(nèi)科疾病研究。

鄢曉平(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R54

A

1005-9202(2017)13-3177-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.023