陳國(guó)利 鄭志方 李 巍 張學(xué)軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外一科，河北 承德 067000)

慢病毒攜帶的短發(fā)夾RNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞乙酰肝素酶基因表達(dá)的沉默作用

陳國(guó)利 鄭志方1李 巍 張學(xué)軍

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外一科，河北 承德 067000)

目的 通過(guò)構(gòu)建短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，探討慢病毒攜帶的shRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞乙酰肝素酶(HPA)基因表達(dá)的沉默作用。方法 采用RNA干擾(RNAi)序列設(shè)計(jì)原則，以乳腺癌HPA基因?yàn)榘谢?，將?gòu)建5對(duì)shRNA重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)Western印跡檢測(cè)HPA-shRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞HPA蛋白表達(dá)水平的影響；用CCK-8的方法檢測(cè)HPA-shRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，運(yùn)用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPA-shRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。進(jìn)一步，運(yùn)用流式分析的方法檢測(cè)HPA-shRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響。建立小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，檢測(cè)HPA-shRNA在體內(nèi)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果 成功構(gòu)建HPA-shRNA重組慢病毒載體。在體外，實(shí)驗(yàn)組HPA-shRNA1組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組有效沉默了人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞HPA的表達(dá)，HPA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。HPA-shRNA1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有良好的抑制作用，HPA-shRNA1能夠增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。此外，HPA-shRNA1能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞在S期發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。在體內(nèi)，HPA-shRNA1組HPA基因mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，HPA-shRNA1能夠沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表達(dá)。在體內(nèi)HPA-shRNA1同樣能夠抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論 HPA-shRNA重組慢病毒載體可有效抑制乳腺癌HPA基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。

乙酰肝素酶；乳腺癌；慢病毒載體；短發(fā)夾RNA；MDA-MB-231細(xì)胞

新發(fā)乳腺癌患者逐年遞增〔1〕，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一直是腫瘤科的難題，嚴(yán)重影響患者療效。研究乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制為臨床采取有針對(duì)性的防治措施，防止乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，減輕患者的痛苦，延長(zhǎng)患者的生存期具有重要的意義。乙酰肝素酶(HPA)是一種能夠裂解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)的β-D葡萄糖醛酸酶，HPA的活性與腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)〔2〕。HPA的高表達(dá)與乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔3〕。本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，構(gòu)建HPA-短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究靶向沉默乳腺癌HPA基因的表達(dá)，為乳腺癌的基因靶向治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 慢病毒包裝293T細(xì)胞和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，L-15培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，鼠單克隆HPA抗體購(gòu)自Abcam公司，慢病毒系統(tǒng)(轉(zhuǎn)移載體、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四質(zhì)粒) 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，SYBR Premix Ex Taq熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司，健康BALB/C雌性裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株接種L-15培養(yǎng)基中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 靶向HPA-shRNA序列設(shè)計(jì) 以HPA基因?yàn)榘谢?，根?jù)shRNA序列計(jì)基本原則設(shè)計(jì)出的shRNA序列分別為：HPA-shRNA1：5′GCTGCCTAGATGTGCGCCTATACA3′；HPA-shRNA2：5′GCATAACTACTATTTATTGAATGG3′；HPA-shRNA3：5′GCACGGGTGCAAGGTATTTCAAAG3′；HPA-shRNA4：5′GCTGCCCAGCTTTCTTGGCATATA3′；HPA-shRNA5：5′GGAGCCACAAGCTCTACCGCATAT3′；陰性對(duì)照：5′GTTGCCCGAACGTGTGAACACGT3′。

1.2.3 HPA-shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA，PCR擴(kuò)增、回收、純化。雙鏈DNA經(jīng)T4 DNA連接酶與線性化質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 HPA-shRNA重組慢病毒的包裝和滴度測(cè)定 用10%胎牛血清(FBS)+杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%進(jìn)行細(xì)胞傳代，把細(xì)胞平均分到3個(gè)25 cm2培養(yǎng)皿中過(guò)夜。細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%開(kāi)始轉(zhuǎn)染，病毒包裝質(zhì)粒和HPA基因RNAi序列重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后收集上清液，離心過(guò)濾并濃縮得到慢病毒液，分裝保存在-80℃。病毒原液10 μl用10倍有限稀釋法稀釋后依次浸染293T細(xì)胞，72 h后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，可測(cè)出慢病毒原液滴度。

1.2.5 MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPA-shRNA重組慢病毒效果檢測(cè) 細(xì)胞分為6組：①HPA-shRNA1組；②HPA-shRNA2組；③HPA-shRNA3組；④HPA-shRNA4組；⑤HPA-shRNA5組；⑥陰性對(duì)照組。①～⑥MDA-MB-231細(xì)胞組分別轉(zhuǎn)染HPA shRNA1、2、3、4、5、陰性對(duì)照組慢病毒。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)HPA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染72 h，PBS洗滌細(xì)胞，通過(guò)RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，電泳分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜封閉，2 h后加入HPA單克隆抗體，4℃溫育過(guò)夜，洗滌后加入稀釋的二抗，室溫溫育2 h后顯色，以GAPDH作為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.7 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性 取適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液在96孔板中接種細(xì)胞(100 μl/孔)。將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5%CO2)。分別于1，2，3，4 d，向每孔加入10 μl CCK-8溶液。③將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。

1.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用健康BALB/C雌性裸鼠，將裸鼠隨機(jī)分2組(實(shí)驗(yàn)HPA-shRNA1組、陰性對(duì)照組)，每組4只，構(gòu)建乳腺癌皮下移植瘤模型。

1.3.2 構(gòu)建腫瘤模型 MDA-MB-231細(xì)胞配成1×109細(xì)胞/ml懸液，取0.2 ml注射裸鼠右側(cè)腋窩，裸鼠右側(cè)腋窩出現(xiàn)一個(gè)球形凸起。觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 HPA-shRNA重組慢病毒注射 將體外實(shí)驗(yàn)篩選的沉默MDA-MB-231細(xì)胞HPA表達(dá)的HPA-shRNA1序列包裝成重組慢病毒。當(dāng)腫瘤直徑約10 mm，攜帶HPA-shRNA1、HPA-陰性對(duì)照的重組慢病毒分別注射各組裸鼠移植瘤，隔日1次，分4次，每只裸鼠總量400 μl，觀察MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)情況、5-氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及細(xì)胞周期情況。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)裸鼠乳腺癌移植瘤HPA mRNA的表達(dá) HPA-shRNA重組慢病毒注射裸鼠移植瘤1個(gè)月，將每組裸鼠分別逐一編號(hào)，共2組，每組4只。手術(shù)剝離出移植瘤，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HPA mRNA表達(dá)。提取總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA含量，瓊脂糖凝膠電泳得到5.8 S、18 S、28 S三條帶，提取的RNA純度良好。按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HPA-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建和測(cè)序 構(gòu)建的特異性靶向抑制人HPA基因的5個(gè)重組慢病毒表達(dá)載體HPA-shRNA1、2、3、4、5，經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)插入的堿基序列與設(shè)計(jì)的5個(gè)HPA-shRNA序列完全一致，表明成功構(gòu)建了HPA-shRNA重組慢病毒表達(dá)載體。

2.2 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPA-shRNA重組慢病毒效果檢測(cè) 用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPA-shRNA重組慢病毒，轉(zhuǎn)染72 h后可見(jiàn)大多數(shù)MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白(圖1)，證明轉(zhuǎn)染效率較高。

2.3 Western印跡檢測(cè)HPA蛋白表達(dá) HPA-shRNA1組、HPA-shRNA2組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組、HPA-shRNA5組、陰性對(duì)照組HPA蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.023±0.015、0.447±0.140、0.083±0.035、0.033±0.015、0.917±0.075、0.947±0.051。HPA-shRNA1組、HPA-shRNA3組、HPA-shRNA4組HPA蛋白的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，表明HPA-shRNA1、HPA-shRNA3、HPA-shRNA4能夠下調(diào)HPA基因蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染72 h前后MDA-MB-231細(xì)胞熒光圖片(×200)

1、HPA-shRNA1組；2、HPA-shRNA2組；3、HPA-shRNA3組；4、HPA-shRNA4組；5、HPA-shRNA5組；6、陰性對(duì)照組圖2 Western印跡檢測(cè)HPA蛋白的表達(dá)

2.4 HPA-shRNA1抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng) 與陰性對(duì)照組相比，MDA-MB-231轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1組的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，增殖率顯著低于陰性對(duì)照組，HPA-ShRNA1組第2，3，4天OD值分別為0.741±0.059，0.833±0.063，0.926±0.069，陰性對(duì)照組第2，3，4天OD值分別為1.173±0.045，1.341±0.061，1.512±0.091，自第2天起兩組OD值有顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力被顯著抑制。

2.5 HPA-shRNA1增強(qiáng)5-Fu對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用 與陰性對(duì)照組相比，5-Fu能夠顯著抑制轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1 的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力，并且隨著5-Fu濃度的增加，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的抑制率增強(qiáng)。0.400、2.000、10.000、50.000、250.000 μg/ml時(shí)，HPA陰性對(duì)照組OD值分別為1.539±0.077、1.337±0.049、0.949±0.055、0.631±0.032、0.315±0.021，而且HPA-shRNA1組OD值分別為0.956±0.055、0.598±0.023、0.551±0.042、0.332±0.054、0.100±0.013，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 HPA-shRNA1抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力 兩組細(xì)胞中，均有部分細(xì)胞能穿過(guò)transwell小室底部的8 μm小孔，轉(zhuǎn)染空載病毒的陰性對(duì)照組細(xì)胞穿過(guò)小孔的細(xì)胞數(shù)量明顯高于轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1組。因此，HPA-shRNA1能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖3。

圖3 HPA-shRNA1抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力

圖4 兩組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況

2.7 HPA-shRNA1誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯 乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1病毒孵育72 h后，用流式分析的方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的周期，陰性對(duì)照組細(xì)胞G1、G2、S期比例分級(jí)為：70.57%、2.2%、27.23%；HPA-shRNA1組細(xì)胞G1、G2、S期比例分別為59.31%、1.41%、39.82%。與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，HPA-shRNA1組細(xì)胞發(fā)生顯著的S期細(xì)胞阻滯。

2.8 HPA-shRNA1在體內(nèi)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及移植病內(nèi)HPA mRNA表達(dá)水平 如圖4。觀察兩組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，30 d后，將轉(zhuǎn)染HPA-shRNA1和空載的病毒的小鼠腫瘤取出，HPA-shRNA1能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)見(jiàn)圖4。HPA-shRNA1組HPA mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.183±0.075)明顯低于陰性對(duì)照組(0.933±0.206，P<0.05)；表明在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，HPA-shRNA1能夠下調(diào)乳腺癌移植瘤HPA mRNA表達(dá)。

3 討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移仍然是癌癥患者的主要死亡原因。研究表明〔4〕，腫瘤的轉(zhuǎn)移與多種蛋白酶有關(guān)，如金屬蛋白酶、HPA等。HPA作為葡萄糖醛酸酶，是一種哺乳動(dòng)物糖類(lèi)內(nèi)切酶，能夠降解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)的硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，在大多數(shù)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)〔5～8〕。而在人類(lèi)正常組織，HPA含量低表達(dá)，主要分布肝細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等〔9〕。HPA有兩種形式，即HPA和HPA2，其中HPA和腫瘤侵襲有關(guān)，而HPA2調(diào)節(jié)其活性，其活性在惡性腫瘤高于良性腫瘤〔10〕。人類(lèi)HPA的前體是一種由543個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的活化與切除一個(gè)內(nèi)部連接片段有關(guān)，切除后產(chǎn)生具有活性的異質(zhì)二聚體，切除位于兩個(gè)功能組織蛋白酶連接片段的C端的10個(gè)氨基酸是激活HPA前體的關(guān)鍵〔11〕。

HPA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C是重要的細(xì)胞因子，促進(jìn)許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成，腫瘤通過(guò)釋放降解基底膜(BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的酶促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔12〕。HPA的活性和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，其能夠裂解和破壞上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的ECM和BM的HS側(cè)鏈，提高腫瘤細(xì)胞的播散能力。研究表明，HPA的表達(dá)可以減少細(xì)胞核syndecan-1的含量，增加組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)的活性，從而上調(diào)侵襲性腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平〔13〕。HPA作為侵襲性腫瘤相關(guān)蛋白的激活蛋白，在一定程度上提高了腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等。HPA的β-D葡萄糖醛酸酶活性和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、黏附和免疫細(xì)胞的激活密切相關(guān)，從而參與新血管形成、炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)〔5〕。

HPA與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如淋巴瘤、膽囊癌、腎癌、骨肉瘤、肝癌、黑色素瘤等〔14～19〕。另外，HPA在乳腺癌中高表達(dá)，而在癌旁正常組織低表達(dá)〔20〕。因此，以HPA為抗原，研究以HPA為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法，然而，單一腫瘤疫苗的免疫激發(fā)功能較低，需要佐劑提高其免疫激發(fā)功能，甲殼低聚糖已被證明是一種有效的以HPA為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗佐劑〔21〕。

慢病毒載體是能傳遞遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的重要的工具〔22〕。為了將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，采用合適的載體是腫瘤基因靶向治療的關(guān)鍵之一，慢病毒是基因轉(zhuǎn)移成熟載體，慢病毒載體廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療〔23〕。與其他載體相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：①轉(zhuǎn)染效率高〔24〕；②對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有轉(zhuǎn)染作用，并能夠使目的基因在靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，且具有安全、低毒、高穩(wěn)定性。本研究表明慢病毒作為shRNA轉(zhuǎn)移載體是可行的。

RNAi參與天然免疫反應(yīng)，可以保護(hù)細(xì)胞免受病原體(如病毒和細(xì)菌)的入侵，沉默同源目標(biāo)靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)〔25〕。RNAi通過(guò)不同的信使RNA降解途徑沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，RNAi主要通過(guò)三種方式進(jìn)行基因調(diào)控：微小RNA(microRNA)、shRNA和小干擾RNA(siRNA)〔26〕。

有研究表明，抑制HPA的表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔27〕，本研究證實(shí)了在乳腺癌中，應(yīng)用HPA-shRNA降低HPA在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)，能夠抑制其增殖和侵襲能力。目前5-Fu廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療，但是，耐藥不僅降低乳腺癌患者的生存期，同時(shí)降低患者的生活質(zhì)量〔28〕，本研究證實(shí)，HPA-shRNA1能夠增強(qiáng)5-Fu對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷能力，增強(qiáng)化療藥物的敏感性，為乳腺癌耐藥患者提供了新的治療途徑，可能是由于HPA與細(xì)胞周期相關(guān)〔29〕。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.20151029)

陳國(guó)利(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤治療的研究。

R655.8

A

1005-9202(2017)13-3169-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.021

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科