趙雪松 呂 巖 張 斌

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

老年糖尿病患者白色念珠菌感染臨床分離株的基因分型

趙雪松 呂 巖 張 斌

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討老年糖尿病患者白色念珠菌感染臨床分離株的基因分型方法。方法 老年糖尿病患者發(fā)生念珠菌感染的臨床標(biāo)本185例，采用API20CAUX 酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定，提取DNA后采用PCR方法擴(kuò)增白色念珠菌25S rDNA基因內(nèi)含子區(qū)和特征性重復(fù)序列(RPS)對(duì)白色念珠菌進(jìn)行基因分型。結(jié)果 采用25S rDNA引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別為450 bp、840 bp及450和840 bp，分別代表基因型A、B、C；185例樣本菌株中，51.9%為A型，29.2%為B型，18.9%為C型；采用根據(jù)ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物可將基因型A、B、C分為10個(gè)亞組，A型中24例為A2，50例為A3，12例為A2/3，8例為A3/4。54例B型中，15例為B2，7例為B3，25例為B2/3，7例為B3/4。35例C型中25例為C2，10例為C2/3。結(jié)論 利用25S rDNA和ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌進(jìn)行基因分型方法具有快速、簡(jiǎn)捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可提高治療效果，減少抗生素濫用和耐藥性的產(chǎn)生。

糖尿??；白色念珠菌；分離株；基因分型

目前我國(guó)老年糖尿病患者合并真菌感染發(fā)病率不斷升高，且以白色念珠菌感染為主〔1〕。通常老年患者病情相當(dāng)復(fù)雜、嚴(yán)重，死亡率較高〔2〕。由于老年患者特殊性，可選擇抗真菌藥物較少〔3〕。本研究通過(guò)對(duì)我院近2年來(lái)內(nèi)分泌科老年糖尿病患者感染白色念珠菌臨床分離株進(jìn)行基因分型研究，確定其分型，分析菌株遺傳相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年1月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的老年糖尿病患者發(fā)生念珠菌感染的臨床標(biāo)本185例(包含取自經(jīng)臨床確診為糖尿病真菌感染老年患者的痰、大小便、咽拭子、嘔吐物等標(biāo)本分離出的白色念珠菌)，男90例，女95例，年齡65～98〔平均(76.2±3.4)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢查，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定和藥敏分析后的臨床分離株進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)分型。采用法國(guó)科瑪嘉(ChromG A)顯色培養(yǎng)基初篩，珠海黑馬Bact-IST藥敏分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏分析，使用梅里埃生物公司API20CAUX 酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定白色念珠菌。

1.2.2 白色念珠菌DNA提取 挑取鑒定培養(yǎng)基上的綠色菌落，分離單菌落后加入酵母漫出粉胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隔天將1 ml培養(yǎng)物離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，采用玻璃珠-苯酚-氯仿法提取白色念珠菌基因組DNA。

1.2.3 PCR引物 臨床常對(duì)老年糖尿病患者分離樣本采用CALB1、CALB2引物擴(kuò)增菌體DNA，產(chǎn)物273 bp代表含有白色念珠菌。采用PCR方法擴(kuò)增白色念珠菌25S rDNA基因內(nèi)含子區(qū)，以?xún)?nèi)含子大小及其中可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子片段的缺失或插入作為分型依據(jù)，可將白色念珠菌分為5種亞型(A/B/C/D/E)，CA-INT-R引物序列：5′-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度450 bp、840 bp、450 bp & 840 bp、1 040 bp、1 050 bp；依次對(duì)應(yīng)A、B、C、D、E型。同時(shí)有文獻(xiàn)〔4〕報(bào)道采用染色體的172 bp長(zhǎng)的特征性重復(fù)序列(RPS)對(duì)白色念珠菌進(jìn)行種內(nèi)基因分型，可根據(jù)電泳結(jié)果分離6種亞型。ASDcF：5′-TGATGAACCACATGTGCTACAAAG-3′，Pcscr：5′-CGCCTCTATTGGTCGAGCAGTAGTC-3′；擴(kuò)增長(zhǎng)度526、698、870、1 042、1 214、1 396 bp，依次對(duì)應(yīng)1～6型。

1.2.4 PCR程序 PCR反應(yīng)總體積30 μl，含TaqDNA聚合酶0.2 μl(1 U,Selleck,B21101a)，dNTP 1.5 μl(thermos,10 mmol/L each)，引物P1、P2(生工，2 OD)各1 μl。擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 40 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR采用Thermal cycler(Techne，TC512，England)擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 V/cm在20℃ 20 min后檢測(cè)。

2 結(jié) 果

本研究中收集的臨床老年糖尿病患者樣本中均檢測(cè)出白色念珠菌的存在。見(jiàn)圖1。所有收集的臨床樣本分別采用兩對(duì)引物(Gen Bankaccession nos.L47111，L28817)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。其中采用25S rDNA引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別為450 bp、840 bp及450 bp和840 bp，分別代表基因型A、B、C。老年糖尿病患者白色念珠菌采用25S rDNA引物擴(kuò)增基因型，在185例樣本菌株中，96例(51.8%)為A型，54例(29.2%)為B型，35例(19.0%)為C型，而基因型D和E并未在此次收集的臨床樣本中檢測(cè)到。見(jiàn)圖2。采用根據(jù)ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物可將基因型A、B、C分為10個(gè)亞組。老年糖尿病患者白色念珠菌采用RPS引物擴(kuò)增基因型，96例A型中24例為A2，50例為A3，12例為A2/3，8例為A3/4。54例B型中，15例為B2，7例為B3，25例為B2/3，7例為B3/4。35例C型中25例為C2，10例為C2/3。見(jiàn)圖3。

1∶100 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根，MD109)；2：白色念珠菌陽(yáng)性對(duì)照(ATCC 10231)；3～10：老年糖尿病患者分離樣本根據(jù)CALB1、CALB2擴(kuò)增產(chǎn)物273 bp；11～14：陰性對(duì)照光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯假絲酵母、類(lèi)星形念珠菌；15:1 kb分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根，MD111)圖1 臨床樣本中菌體檢測(cè)結(jié)果

1～6:450 bp，A型；7～11：840 bp，B型；13～15：450+840 bp，C型圖2 老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌25S rDNA引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1～3：B2亞型，698 bp；4～6：B3亞型，870 bp；7～9：2/3亞型，698 bp+870 bp；10～11：3/4亞型，870 bp+1-42 bp圖3 老年糖尿病患者樣本白色念珠菌RPS引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因亞型分型結(jié)果

3 討 論

隨著白色念珠菌臨床病例不斷增加，分子分型技術(shù)已成為研究念珠菌病流行病學(xué)及合理選擇藥物的基礎(chǔ)。分子生物學(xué)方法已應(yīng)用于深部真菌病的診斷和分型研究，形成了以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的一系列分子診斷方法，成為感染菌種(型)的早期鑒定和指導(dǎo)前期治療的有力工具〔5〕。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)白假絲酵母菌分型的報(bào)道很多〔6〕，主要有傳統(tǒng)的表型分型方法和基因分型方法。表型分型存在鑒別力弱、重復(fù)性差、實(shí)驗(yàn)結(jié)果變異大、易受環(huán)境及人為因素影響、耗時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn);基因分型是以生物體DNA 序列的差異為基礎(chǔ)建立的顯示基因組多態(tài)性的方法〔7〕?；诤怂岬姆肿由飳W(xué)方法(主要是PCR方法)是念珠菌診斷、分型的發(fā)展趨勢(shì)，PCR基因分型方法具有快速、簡(jiǎn)捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)從模板DNA提取到PCR擴(kuò)增后電泳觀察結(jié)果，共耗時(shí)6 h左右，可在1個(gè)工作日內(nèi)完成，比較適合臨床念珠菌種內(nèi)和種間分型研究。本課題首次將白色念珠菌基因分型應(yīng)用于糖尿病老年患者中，為治療和預(yù)防糖尿病老年患者的真菌感染提供依據(jù)。

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌―代謝疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，尤其在老年患者中尤為突出〔8〕。同時(shí)，隨著近年來(lái)抗生素及免疫抑制劑的普遍應(yīng)用和濫用，使真菌感染的發(fā)病率有明顯增加趨勢(shì)〔9〕，尤其是免疫功能低下的糖尿病患者更為真菌感染提供了充足的條件〔10〕，從淺部到深部的真菌感染率都明顯高于非糖尿病病人，且以白色念珠菌感染最為常見(jiàn)〔11〕。本課題采用PCR分型方法，對(duì)取自老年糖尿病患者感染白色念珠菌臨床分離株進(jìn)行基因分型，確定其分型。

本研究結(jié)果表明，老年糖尿病患者的白色念珠菌基因型分布尚無(wú)明顯的規(guī)律和風(fēng)險(xiǎn)因素，最近有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)〔12〕,同一老年患者身體不同部位分離出不同基因型白色念珠菌，但目前尚無(wú)研究明確表明同一部位感染是單一基因型或多個(gè)基因型菌株混合感染導(dǎo)致。對(duì)引起老年糖尿病患者感染白色念珠菌進(jìn)行基因分型研究，初步闡明造成老年糖尿病患者感染白色念珠菌是多基因型株系的,但仍需繼續(xù)對(duì)上述樣本的基因型與白色念珠菌菌株分布及耐藥性進(jìn)行系統(tǒng)的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究結(jié)果提示利用25S rDNA和ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌進(jìn)行基因分型方法具有快速、簡(jiǎn)捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可提高治療效果，減少抗生素濫用和耐藥性的產(chǎn)生。

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〔2017-01-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

齊齊哈爾科學(xué)技術(shù)局指令性計(jì)劃項(xiàng)目(No.SFGG-201320)

趙雪松(1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事微生物檢驗(yàn)、細(xì)菌和真菌耐藥監(jiān)測(cè)研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)13-3167-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.020