趙雪松 呂 巖 張 斌

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

老年糖尿病患者白色念珠菌感染臨床分離株的基因分型

趙雪松 呂 巖 張 斌

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討老年糖尿病患者白色念珠菌感染臨床分離株的基因分型方法。方法 老年糖尿病患者發(fā)生念珠菌感染的臨床標(biāo)本185例，采用API20CAUX 酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定，提取DNA后采用PCR方法擴增白色念珠菌25S rDNA基因內(nèi)含子區(qū)和特征性重復(fù)序列(RPS)對白色念珠菌進(jìn)行基因分型。結(jié)果 采用25S rDNA引物擴增后的產(chǎn)物分別為450 bp、840 bp及450和840 bp，分別代表基因型A、B、C；185例樣本菌株中，51.9%為A型，29.2%為B型，18.9%為C型；采用根據(jù)ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計引物擴增后的產(chǎn)物可將基因型A、B、C分為10個亞組，A型中24例為A2，50例為A3，12例為A2/3，8例為A3/4。54例B型中，15例為B2，7例為B3，25例為B2/3，7例為B3/4。35例C型中25例為C2，10例為C2/3。結(jié)論 利用25S rDNA和ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計引物擴增產(chǎn)物對老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌進(jìn)行基因分型方法具有快速、簡捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點，可提高治療效果，減少抗生素濫用和耐藥性的產(chǎn)生。

糖尿??；白色念珠菌；分離株；基因分型

目前我國老年糖尿病患者合并真菌感染發(fā)病率不斷升高，且以白色念珠菌感染為主〔1〕。通常老年患者病情相當(dāng)復(fù)雜、嚴(yán)重，死亡率較高〔2〕。由于老年患者特殊性，可選擇抗真菌藥物較少〔3〕。本研究通過對我院近2年來內(nèi)分泌科老年糖尿病患者感染白色念珠菌臨床分離株進(jìn)行基因分型研究，確定其分型，分析菌株遺傳相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年1月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的老年糖尿病患者發(fā)生念珠菌感染的臨床標(biāo)本185例(包含取自經(jīng)臨床確診為糖尿病真菌感染老年患者的痰、大小便、咽拭子、嘔吐物等標(biāo)本分離出的白色念珠菌)，男90例，女95例，年齡65～98〔平均(76.2±3.4)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 對標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢查，經(jīng)實驗室鑒定和藥敏分析后的臨床分離株進(jìn)行PCR技術(shù)檢測分型。采用法國科瑪嘉(ChromG A)顯色培養(yǎng)基初篩，珠海黑馬Bact-IST藥敏分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏分析，使用梅里埃生物公司API20CAUX 酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定白色念珠菌。

1.2.2 白色念珠菌DNA提取 挑取鑒定培養(yǎng)基上的綠色菌落，分離單菌落后加入酵母漫出粉胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)過夜，隔天將1 ml培養(yǎng)物離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，采用玻璃珠-苯酚-氯仿法提取白色念珠菌基因組DNA。

1.2.3 PCR引物 臨床常對老年糖尿病患者分離樣本采用CALB1、CALB2引物擴增菌體DNA，產(chǎn)物273 bp代表含有白色念珠菌。采用PCR方法擴增白色念珠菌25S rDNA基因內(nèi)含子區(qū)，以內(nèi)含子大小及其中可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子片段的缺失或插入作為分型依據(jù)，可將白色念珠菌分為5種亞型(A/B/C/D/E)，CA-INT-R引物序列：5′-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3′，擴增長度450 bp、840 bp、450 bp & 840 bp、1 040 bp、1 050 bp；依次對應(yīng)A、B、C、D、E型。同時有文獻(xiàn)〔4〕報道采用染色體的172 bp長的特征性重復(fù)序列(RPS)對白色念珠菌進(jìn)行種內(nèi)基因分型，可根據(jù)電泳結(jié)果分離6種亞型。ASDcF：5′-TGATGAACCACATGTGCTACAAAG-3′，Pcscr：5′-CGCCTCTATTGGTCGAGCAGTAGTC-3′；擴增長度526、698、870、1 042、1 214、1 396 bp，依次對應(yīng)1～6型。

1.2.4 PCR程序 PCR反應(yīng)總體積30 μl，含TaqDNA聚合酶0.2 μl(1 U,Selleck,B21101a)，dNTP 1.5 μl(thermos,10 mmol/L each)，引物P1、P2(生工，2 OD)各1 μl。擴增程序：預(yù)變性94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 40 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR采用Thermal cycler(Techne，TC512，England)擴增。將擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 V/cm在20℃ 20 min后檢測。

2 結(jié) 果

本研究中收集的臨床老年糖尿病患者樣本中均檢測出白色念珠菌的存在。見圖1。所有收集的臨床樣本分別采用兩對引物(Gen Bankaccession nos.L47111，L28817)進(jìn)行PCR擴增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。其中采用25S rDNA引物擴增后的產(chǎn)物分別為450 bp、840 bp及450 bp和840 bp，分別代表基因型A、B、C。老年糖尿病患者白色念珠菌采用25S rDNA引物擴增基因型，在185例樣本菌株中，96例(51.8%)為A型，54例(29.2%)為B型，35例(19.0%)為C型，而基因型D和E并未在此次收集的臨床樣本中檢測到。見圖2。采用根據(jù)ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計引物擴增后的產(chǎn)物可將基因型A、B、C分為10個亞組。老年糖尿病患者白色念珠菌采用RPS引物擴增基因型，96例A型中24例為A2，50例為A3，12例為A2/3，8例為A3/4。54例B型中，15例為B2，7例為B3，25例為B2/3，7例為B3/4。35例C型中25例為C2，10例為C2/3。見圖3。

1∶100 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根，MD109)；2：白色念珠菌陽性對照(ATCC 10231)；3～10：老年糖尿病患者分離樣本根據(jù)CALB1、CALB2擴增產(chǎn)物273 bp；11～14：陰性對照光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克魯斯假絲酵母、類星形念珠菌；15:1 kb分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根，MD111)圖1 臨床樣本中菌體檢測結(jié)果

1～6:450 bp，A型；7～11：840 bp，B型；13～15：450+840 bp，C型圖2 老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌25S rDNA引物PCR擴增產(chǎn)物

1～3：B2亞型，698 bp；4～6：B3亞型，870 bp；7～9：2/3亞型，698 bp+870 bp；10～11：3/4亞型，870 bp+1-42 bp圖3 老年糖尿病患者樣本白色念珠菌RPS引物PCR擴增產(chǎn)物基因亞型分型結(jié)果

3 討 論

隨著白色念珠菌臨床病例不斷增加，分子分型技術(shù)已成為研究念珠菌病流行病學(xué)及合理選擇藥物的基礎(chǔ)。分子生物學(xué)方法已應(yīng)用于深部真菌病的診斷和分型研究，形成了以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的一系列分子診斷方法，成為感染菌種(型)的早期鑒定和指導(dǎo)前期治療的有力工具〔5〕。近年來，國內(nèi)外有關(guān)白假絲酵母菌分型的報道很多〔6〕，主要有傳統(tǒng)的表型分型方法和基因分型方法。表型分型存在鑒別力弱、重復(fù)性差、實驗結(jié)果變異大、易受環(huán)境及人為因素影響、耗時費力等缺點;基因分型是以生物體DNA 序列的差異為基礎(chǔ)建立的顯示基因組多態(tài)性的方法〔7〕。基于核酸的分子生物學(xué)方法(主要是PCR方法)是念珠菌診斷、分型的發(fā)展趨勢，PCR基因分型方法具有快速、簡捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點。實驗從模板DNA提取到PCR擴增后電泳觀察結(jié)果，共耗時6 h左右，可在1個工作日內(nèi)完成，比較適合臨床念珠菌種內(nèi)和種間分型研究。本課題首次將白色念珠菌基因分型應(yīng)用于糖尿病老年患者中，為治療和預(yù)防糖尿病老年患者的真菌感染提供依據(jù)。

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌―代謝疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其在老年患者中尤為突出〔8〕。同時，隨著近年來抗生素及免疫抑制劑的普遍應(yīng)用和濫用，使真菌感染的發(fā)病率有明顯增加趨勢〔9〕，尤其是免疫功能低下的糖尿病患者更為真菌感染提供了充足的條件〔10〕，從淺部到深部的真菌感染率都明顯高于非糖尿病病人，且以白色念珠菌感染最為常見〔11〕。本課題采用PCR分型方法，對取自老年糖尿病患者感染白色念珠菌臨床分離株進(jìn)行基因分型，確定其分型。

本研究結(jié)果表明，老年糖尿病患者的白色念珠菌基因型分布尚無明顯的規(guī)律和風(fēng)險因素，最近有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)〔12〕,同一老年患者身體不同部位分離出不同基因型白色念珠菌，但目前尚無研究明確表明同一部位感染是單一基因型或多個基因型菌株混合感染導(dǎo)致。對引起老年糖尿病患者感染白色念珠菌進(jìn)行基因分型研究，初步闡明造成老年糖尿病患者感染白色念珠菌是多基因型株系的,但仍需繼續(xù)對上述樣本的基因型與白色念珠菌菌株分布及耐藥性進(jìn)行系統(tǒng)的相關(guān)性統(tǒng)計學(xué)分析。

本研究結(jié)果提示利用25S rDNA和ALT重復(fù)序列RPS設(shè)計引物擴增產(chǎn)物對老年糖尿病患者樣本中白色念珠菌進(jìn)行基因分型方法具有快速、簡捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點，可提高治療效果，減少抗生素濫用和耐藥性的產(chǎn)生。

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〔2017-01-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

齊齊哈爾科學(xué)技術(shù)局指令性計劃項目(No.SFGG-201320)

趙雪松(1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事微生物檢驗、細(xì)菌和真菌耐藥監(jiān)測研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)13-3167-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.020