李素婷 王 冉 杜 超 高玉峰 吳曉光

(承德醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北 承德 067000)

益心酮片對(duì)亞急性酒精性肝損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響

李素婷 王 冉 杜 超 高玉峰 吳曉光

(承德醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北 承德 067000)

目的 研究益心酮片對(duì)亞急性酒精性肝損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響。方法 選擇雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、益心酮低、高劑量組和維生素E組。以56°北京二鍋頭白酒連續(xù)灌胃4 w建立大鼠亞急性酒精性肝損傷模型，造模同時(shí)每天按劑量(100、200 mg/kg)給予益心酮干預(yù)，檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性，肝組織丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性，并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察。結(jié)果 益心酮能明顯降低大鼠血清ALT、AST活性，提高肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性，降低MDA含量，并能減輕酒精引起的肝組織病理?yè)p傷。結(jié)論 益心酮可能通過(guò)提高內(nèi)源性抗氧化能酶活性，抑制大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷保護(hù)酒精性肝損傷。

益心酮；酒精性肝損傷；氧化應(yīng)激

酒精性肝病是長(zhǎng)期或大量飲酒所引起的肝臟損害〔1〕。酒精性肝病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，酒精及其代謝產(chǎn)物的毒性作用、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、腸源性?xún)?nèi)毒素、遺傳因素等多種因素參與其發(fā)生發(fā)展〔2〕。目前研究認(rèn)為，過(guò)量飲酒時(shí)酒精在肝臟代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)所引起的氧化應(yīng)激是引起酒精性肝病的一個(gè)重要原因〔3〕。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)酒精性肝病尚無(wú)有效的干預(yù)措施，而中藥具有多靶點(diǎn)、多層次、多途徑及協(xié)調(diào)作用等特點(diǎn)，在抑制氧化應(yīng)激，防治酒精性肝病方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值〔4〕。山楂葉總黃酮是一種天然的植物提取物，因富含黃酮類(lèi)成分而具有明顯的清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒調(diào)節(jié)免疫、保肝等廣泛的藥理作用〔5〕，其制劑益心酮片作為降血脂、預(yù)防心腦血管供血不足用藥應(yīng)用于臨床。本研究觀察益心酮對(duì)酒精所致大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重(180±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：scxk(2007-2009)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水及進(jìn)食普通飼料。

1.2 藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 益心酮片(山楂葉總黃酮制劑，每片含山楂葉總黃酮32 mg)：購(gòu)于山西振東泰盛制藥有限公司，臨床應(yīng)用2～3片/次，3次/d，即192～288 mg/d，以成人體重60 kg 計(jì)算，相當(dāng)3.2～4.8 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)給大鼠灌胃100、200 mg/kg，約為成人用量的20～40倍，臨用前用蒸餾水將益心酮片配置成不同濃度的混懸液；56°紅星二鍋頭白酒：北京紅星釀酒廠生產(chǎn)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所。半自動(dòng)生化分析儀(MD-100)：美國(guó)Bayer公司；721W微機(jī)型分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器五廠；Olympus顯微鏡和組織切片機(jī)：德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥〔6〕60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、益心酮低、高劑量(100、200 mg/kg)組和維生素E(100 mg/kg)組。正常組每天給予蒸餾水0.4 ml灌胃，其余各組每天上午按16 ml/kg劑量灌胃56°白酒1次，連續(xù)灌胃4 w造模結(jié)束。自造模第1天起，益心酮低、高劑量組在每天灌胃白酒1 h后，灌胃益心酮混懸液，維生素E組給予維生素E橄欖油溶液，正常組和模型組灌服等體積蒸餾水，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由飲水、進(jìn)食。最后一次灌胃結(jié)束，禁食不禁水16 h，乙醚麻醉大鼠，剖腹取血、肝組織備用。

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè) 取血分離血清，半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT、AST活性；取部分肝組織，用冷生理鹽水沖洗后制備成10%的肝勻漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性及MDA的含量。

1.3.3 肝臟病理學(xué)檢查 取大鼠肝組織，10%甲醛溶液常規(guī)固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩組比較采用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1 益心酮對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性的影響 模型組大鼠血清ALT、AST活性均顯著升高，和正常組比較有顯著差異(P<0.05)；和模型組比較，益心酮低、高劑量組和維生素E組均能明顯降低大鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05，P<0.01)，表明益心酮能夠保護(hù)大鼠肝細(xì)胞、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，且維生素E組效果優(yōu)于益心酮組。見(jiàn)表1。

2.2 益心酮對(duì)肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性及 MDA含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA含量明顯升高，SOD、GSH、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，益心酮低、高劑量組和維生素E組均可降低大鼠肝組織MDA含量，升高SOD、GSH、GSH-Px活性(P<0.05)。益心酮低、高劑量組之間比較，GSH、GSH-Px有顯著差異(P<0.05)，SOD、MDA無(wú)明顯差異。而維生素E組和益心酮各劑量組比較，MDA、SOD、GSH、GSH-Px均有顯著差異(P<0.05)。表明益心酮能提高內(nèi)源性抗氧化劑水平，具有清除自由基抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力，并具有劑量依賴(lài)性。但抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用效果較弱于維生素E。見(jiàn)表1。

2.3 肝組織病理學(xué)變化 各組大鼠肝組織HE染色后光鏡下觀察，正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝組織無(wú)明顯脂肪變性，肝小葉內(nèi)未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)點(diǎn)狀、灶狀壞死，肝細(xì)胞彌漫性腫脹，并有片狀脂肪樣變性，在匯管區(qū)有可見(jiàn)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。益心酮各劑量組：肝小葉結(jié)構(gòu)基本保留，肝細(xì)胞輕度水腫，脂肪樣變性細(xì)胞明顯減少，肝小葉內(nèi)可見(jiàn)少量點(diǎn)狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；維生素E組：肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞水腫及脂肪樣變性明顯減少，肝小葉內(nèi)偶見(jiàn)少量點(diǎn)狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

表1 益心酮對(duì)各組大鼠血清ALT、AST活性及肝臟SOD、GSH、GSH-Px活性、MDA含量的影響

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；與益心酮低劑量組比較:4)P<0.05；與維生素E組比較:5)P<0.05

圖1 益心酮對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響(HE，×200)

3 討 論

酒精過(guò)量攝入已成為我國(guó)病毒性肝炎之后導(dǎo)致肝臟損傷的第二大病因〔1〕。對(duì)我國(guó)人民身體健康和社會(huì)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。研究表明，酒精在肝臟代謝過(guò)程中產(chǎn)生氧化應(yīng)激是導(dǎo)致酒精性肝損傷最重要的一個(gè)原因〔7〕。大量飲酒后，酒精在肝臟經(jīng)肝微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)代謝產(chǎn)生大量自由基(如：O2-·、OH-·、H2O2等)，這些自由基具有極強(qiáng)的氧化能力，可攻擊肝細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，改變膜流動(dòng)性和通透性，影響DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，并可引起肝內(nèi)ATP和GSH耗竭，導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛損傷〔8〕。脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝終產(chǎn)物MDA還可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體引起相應(yīng)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)，進(jìn)一步加重酒精性肝損傷〔9〕。機(jī)體在代謝酒精時(shí)會(huì)啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)來(lái)干預(yù)氧化應(yīng)激損傷，SOD是清除活ROS的主要的抗氧化酶，它可將氧自由基歧化為H2O2，H2O2進(jìn)一步在過(guò)氧化氫酶、GSH-Px催化下被清除，保護(hù)肝細(xì)胞免被損傷。但是大量攝入酒精時(shí)，酒精可引起肝細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)(維生素E、C、A)明顯減少，進(jìn)而導(dǎo)致SOD活性下降，不能有效清除自由基，致使自由基在體內(nèi)蓄積超過(guò)體內(nèi)抗氧化酶代謝的能力，引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)肝細(xì)胞造成損傷〔10〕。因此檢測(cè)肝組織中SOD活性可以衡量肝臟清除自由基能力及機(jī)體抗氧化能力。GSH是細(xì)胞內(nèi)游離的水溶性抗氧化劑，GSH-Px是體內(nèi)廣泛存在的抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)酶，GSH-Px特異催化GSH還原體內(nèi)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，減輕過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞膜損傷，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。酒精在肝臟的代謝產(chǎn)物乙醛在對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性的同時(shí)會(huì)與GSH、GSH-Px的巰基結(jié)合，加速GSH的耗竭，抑制GSH-Px活性，使內(nèi)源性抗氧化能力下降，加重肝細(xì)胞氧化損傷〔11〕。因此檢測(cè)肝組織GSH含量和GSH-Px活性也是衡量酒精性肝損傷時(shí)肝臟氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)。脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝終產(chǎn)物MDA是氧化應(yīng)激損傷的敏感指標(biāo)，檢測(cè)MDA含量可衡量細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度〔12〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明酒精性肝損傷模型制備成功。酒精誘導(dǎo)大鼠肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。益心酮能保護(hù)肝細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。本研究表明益心酮具有較強(qiáng)的清除自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力，能減少大鼠肝臟內(nèi)GSH的消耗，增強(qiáng)內(nèi)源性SOD、GSH-Px等抗氧化酶的抗氧化能力，抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)肝臟的損傷，對(duì)酒精性肝損傷有確切的保護(hù)作用。維生素E是一種公認(rèn)的抗氧化劑，能清除自由基，提高內(nèi)源性抗氧化酶活性，抑制酒精誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果表明，益心酮和維生素E均能提高肝組織SOD、GSH-Px、GSH水平，降低MDA含量，而維生素E的保肝抗氧化能力優(yōu)于益心酮。

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〔2015-12-22修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.12276104D-93)

李素婷(1963-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥對(duì)肝病防治作用的機(jī)制研究。

R575

A

1005-9202(2017)13-3162-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.018