蘇亞楠 張曉波 姚海濤 陳立強(qiáng)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

山茱萸多糖對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠認(rèn)知能力和海馬磷酸化-tau蛋白表達(dá)的影響

蘇亞楠 張曉波1姚海濤1陳立強(qiáng)1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 觀察山茱萸多糖對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠認(rèn)知能力的影響及作用機(jī)制。方法 100只Wistar大鼠隨機(jī)分為青年組、假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組各20只。采用D-半乳糖聯(lián)合β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～40注射建立AD模型。水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠認(rèn)知能力，免疫組化(SABC)法檢測(cè)大鼠海馬CA4區(qū)磷酸化tau(p-tau)蛋白表達(dá)量。結(jié)果 藥物干預(yù)后，山茱萸多糖組平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)；120 s穿越原平臺(tái)次數(shù)較模型組明顯增加(P<0.05)。山茱萸多糖組海馬區(qū)p-tau蛋白陽(yáng)性染色較模型組明顯減弱(P<0.05)。結(jié)論 山茱萸多糖對(duì)AD大鼠認(rèn)知能力有改善，可能與降低海馬區(qū)p-tau蛋白表達(dá)量相關(guān)。

山茱萸多糖；阿爾茨海默??；磷酸化tau蛋白；認(rèn)知能力

山茱萸多糖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材山茱萸生物學(xué)活性物質(zhì)的重要成分，現(xiàn)已明確其成分主要有木糖和葡萄糖組成的多糖(PFCC)，鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成的多糖(PFCAⅢ)等〔1〕。研究顯示〔2〕多糖有抗氧化、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫功能、抗衰老、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等作用。本實(shí)驗(yàn)觀察β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～40誘導(dǎo)制備阿爾茨海默病(AD)大鼠模型經(jīng)山茱萸多糖干預(yù)后學(xué)習(xí)記憶能力改變、磷酸化tau(p-tau)蛋白表達(dá)變化及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 清潔級(jí)Wistar大鼠100只，3月齡，體重(137.4±12.7)g。常規(guī)飼養(yǎng)，隨機(jī)分為青年組、假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組，每組20只。

1.2 主要試劑 山茱萸多糖提取物(4∶1)購(gòu)自朗林生物制品有限公司；Aβ1～40購(gòu)自無(wú)錫亞肽生物科技有限公司；多奈哌齊由法國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)；兔抗大鼠p-tau抗體(pSer422)由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；免疫組化(SABC)試劑盒、化學(xué)發(fā)光底物(ECL)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 模型制備和給藥 按60 mg·kg-1·d-1給大鼠腹腔連續(xù)注射D-半乳糖。6 w后，山茱萸多糖組、多奈哌齊組、模型組大鼠固定在腦立體定位儀上，依據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》〔3〕行海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1～40溶液1 μl；假手術(shù)組海馬區(qū)注射等量無(wú)菌生理鹽水。術(shù)后7 d，山茱萸多糖組以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃，多奈哌齊組以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組、假手術(shù)組以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)30 d。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè) 造模后第8天、藥物灌胃30 d各組進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。每次共6 d。①定位航行試驗(yàn)：共5 d，上午和下午兩時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練4次，以水池4個(gè)象限作為大鼠的入水點(diǎn)至找到平臺(tái)為止，如大鼠在120 s內(nèi)找到平臺(tái)，平臺(tái)停留30 s；如在120 s未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)停留30 s。記錄大鼠軌跡路線圖，4個(gè)不同象限平均值是該次的逃避潛伏期。②空間探索試驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)及在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.5 取材和檢測(cè) 大鼠灌胃30 d，麻醉后固定于木板平臺(tái)上，打開(kāi)胸腔暴露心臟，將灌注針沿左心室插入主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，0.9%生理鹽水灌注心臟，至大鼠四肢蒼白；換4%多聚甲醛溶液行心臟灌注。斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定。于海馬處取材，SABC法檢測(cè)海馬p-tau蛋白表達(dá)。胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)陽(yáng)性的顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，圖像采集后用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件來(lái)計(jì)算圖像中陽(yáng)性染色的平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)和S-N-K檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組逃避潛伏期比較 干預(yù)前模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組逃避潛伏時(shí)間較青年組和假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)；干預(yù)后與模型組比較，青年組、假手術(shù)組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組明顯縮短(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組干預(yù)前、后平均逃避潛伏期

與青年組、假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2 各組干預(yù)前、后空間探索能力比較 與干預(yù)前比較，多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組干預(yù)后穿越原平臺(tái)次數(shù)均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組海馬p-tau(Ser422)表達(dá) 在海馬 CA4區(qū)，與青年組(0.316 8±0.011 7)、假手術(shù)組(0.319 9±0.013 0)比較，模型組p-tau(Ser422)蛋白(0.402 2±0.014 3)陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組比較，多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白(0.372 3±0.012 1)陽(yáng)性染色均明顯減弱(P<0.05)。而多奈哌齊組，山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白陽(yáng)性染色無(wú)明顯差別(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

表2 各組干預(yù)前、后120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù),次，n=20)

與青年組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與干預(yù)前比較：4)P<0.05

圖1 各組海馬CA4區(qū)p-tau(Ser422)蛋白表達(dá)情況(SABC法，×400)

3 討 論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，最主要病理特征是老年斑〔4〕和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔5，6〕，AD患者癡呆程度與NFTs數(shù)量密切相關(guān)。tau是神經(jīng)元中含量最高的微管相關(guān)蛋白，tau蛋白被過(guò)度磷酸化具有神經(jīng)毒性〔7，8〕。本實(shí)驗(yàn)表明山茱萸多糖在調(diào)節(jié)AD大鼠海馬tau蛋白磷酸化中有積極作用，可改善AD大鼠病理進(jìn)展，達(dá)到防治目的。本實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練中形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知和空間記憶，從信息加工和提取方式來(lái)看屬于陳述性記憶，這種認(rèn)知和記憶主要儲(chǔ)存在邊緣系統(tǒng)(如海馬)和大腦皮層相關(guān)腦區(qū)。癡呆病人最先受損且損傷重的是陳述性記憶。研究證明〔9〕，功能未受損的海馬區(qū)對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶和獲得新信息很重要，Morris〔10〕也證明海馬受損大鼠在水迷宮學(xué)習(xí)中，隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的成績(jī)降低。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明造模大鼠海馬功能受到損害，但這種損害造成海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞功能性改變和空間學(xué)習(xí)、記憶間的關(guān)系一直沒(méi)得到合理解釋。Knierim等〔11〕認(rèn)為這種關(guān)系形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)是由兩種類(lèi)型神經(jīng)元組成，一種是定位神經(jīng)細(xì)胞，是構(gòu)成認(rèn)知地圖的關(guān)鍵因素；一種是方位神經(jīng)細(xì)胞，是構(gòu)成認(rèn)知特定方位關(guān)鍵因素。有學(xué)者〔12〕認(rèn)為神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的變化是直接影響AD患者學(xué)習(xí)、認(rèn)知和記憶的神經(jīng)功能基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明山茱萸多糖對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力有改善作用，間接證明對(duì)海馬區(qū)受損神經(jīng)元和神經(jīng)突觸功能有修復(fù)和保護(hù)作用。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 王一涵)

黑龍江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2013-233)；佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目(L2012-052)；佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院培育課題(jy2014-005)

陳立強(qiáng)(1979-)，男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事神經(jīng)-體液-免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

蘇亞楠(1978-)，女，主管護(hù)師，碩士，主要從事老年癡呆研究。

R34

A

1005-9202(2017)13-3152-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.013

1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院