李新帥

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽(yáng) 473000)

阿米洛利對(duì)氯胺酮麻醉大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì)的影響

李新帥

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽(yáng) 473000)

目的 探討阿米洛利對(duì)氯胺酮麻醉大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì)的影響。方法 選取60只成年雄性SD大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為生理鹽水5 ml·kg-1·h-1組(對(duì)照組)、氯胺酮組40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1組，每組20只，每天持續(xù)靜脈注射2 h，連續(xù)給藥7 d，最后1次給藥24 h后應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠空間記憶能力。水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠取出腦海馬組織，分別應(yīng)用TUNEL法及免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bax、Bcl-2表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定海馬組織勻漿中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及乙酰膽堿(Ach)水平。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第1天氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利組各時(shí)間段逃避潛伏期時(shí)間均短于氯胺酮組(P<0.05)。氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(P<0.05)，而氯胺酮組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)。氯胺酮組海馬勻漿中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利組海馬勻漿中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 阿米洛利對(duì)氯胺酮麻醉后認(rèn)知功能障礙的改善可能與其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì)水平有關(guān)。

阿米洛利；氯胺酮；神經(jīng)細(xì)胞凋亡；神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是外科全麻手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，患者表現(xiàn)為記憶功能下降及認(rèn)知功能損傷〔1〕。氯胺酮麻醉后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率較高，目前認(rèn)為與氯胺酮降低腦組織中神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì)促使炎癥介質(zhì)釋放而誘發(fā)神經(jīng)元損傷有關(guān)〔2〕。阿米洛利屬于保鉀利尿藥物，除了能阻斷鈉離子通道外，同時(shí)對(duì)神經(jīng)中樞多種離子通道有明顯的阻滯效果〔3〕。由于阿米洛利可通過阻滯鈉離子通道從而參與神經(jīng)病理調(diào)節(jié)過程，減輕酸化及缺血灌注所致的神經(jīng)元損傷，因此對(duì)神經(jīng)元功能具有保護(hù)作用〔4〕。本研究探討阿米洛利對(duì)氯胺酮麻醉大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取60只成年雄性SD大鼠，重量180～200 g，購(gòu)于河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(豫)2014-0008。所有大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度設(shè)定為20℃～25℃，濕度控制在60%～70%，燈光晝夜節(jié)律控制(8：00～20：00)。

1.2 主要試劑 復(fù)方鹽酸阿米洛利片(蘇州東瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10900015)；鹽酸氯胺酮注射液(西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20054748)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20056626)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗鼠Bax一抗(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠Bcl-2一抗(上?？道噬锟萍加邢薰?；羊抗兔二抗(南京生興生物技術(shù)有限公司)；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)；乙酰膽堿(Ach)試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)。

1.3 主要儀器 手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械設(shè)備廠)；超聲波清洗儀(型號(hào)：SKE-5S；寧波科麥儀器有限公司)；微量加樣器(北京華儀三譜儀器有限責(zé)任公司)；電子分析天平(型號(hào)：BT125D；賽多利斯儀器有限公司)；秒表(型號(hào)：AMP-ZSD-013；北京西化儀科技有限公司)；Morris水迷宮測(cè)試儀(北京北廣精儀儀器設(shè)備有限公司)；電子顯微鏡(深圳電子顯微鏡生產(chǎn)有限公司)；電熱恒溫箱(邢臺(tái)潤(rùn)聯(lián)科技開發(fā)有限公司)；切片機(jī)(威士達(dá)精密機(jī)械有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及建立氯胺酮麻醉大鼠模型 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為生理鹽水組(對(duì)照組)、氯胺酮組(氯胺酮組)，氯胺酮+阿米洛利組，每組20只。所有大鼠均行尾部靜脈注射，對(duì)照組注射生理鹽水5 ml·kg-1·h-1，氯胺酮組緩慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮+阿米洛利組緩慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1，上述各組大鼠每天恒速輸注2 h，持續(xù)7 d。靜脈輸注過程中密切留意大鼠呼吸強(qiáng)度，并適時(shí)調(diào)整輸注速度，維持呼吸頻率>50次/min，麻醉過程中觀察氣血，排除血?dú)猱惓４笫?，剔除給藥過程中死亡的大鼠，余下大鼠于固定時(shí)間開始水迷宮測(cè)試。

1.4.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試 分別于實(shí)驗(yàn)第1、3、5、7天從每組中選出10只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，水迷宮由直徑130 cm×高50 cm的圓形水池組成，水深30 cm，池水恒溫，池壁上標(biāo)有東南西北4個(gè)入水點(diǎn)，可將水池分SW、NW、SE、NE等4個(gè)象限，在NW象限中央離池壁33 cm處放置直徑9 cm×高29 cm的圓形透明平臺(tái)，并浸沒于水下。在池壁周圍貼上參照線供大鼠定位平臺(tái)，并在迷宮上方安裝攝像頭，記錄大鼠行程，訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。在正式實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行2次預(yù)實(shí)驗(yàn)，第1次將大鼠置于水池邊，讓大鼠在180 s內(nèi)套上高臺(tái)，如在規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠未能上高臺(tái)，研究人員將引導(dǎo)大鼠，將其置于高臺(tái)10 s，相隔5 min后再對(duì)大鼠進(jìn)行培訓(xùn)。第2次培訓(xùn)結(jié)束5 min后進(jìn)行決定性實(shí)驗(yàn)，在水下放置高臺(tái)，讓實(shí)驗(yàn)大鼠在同一水平線出發(fā)登上高臺(tái)，記錄各組大鼠平均逃避潛伏期。

1.4.3 海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測(cè) 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束24 h后處死各組大鼠取出腦海馬組織，經(jīng)甲醛固定，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，在視交叉海馬區(qū)行冠狀切片，切片厚度為5 μm。應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)，以胞體縮小及細(xì)胞核呈棕黃色等形態(tài)學(xué)特征判斷海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，并隨機(jī)選取海馬區(qū)5個(gè)高倍視野(×500)，計(jì)算海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)。

1.4.4 免疫組化法測(cè)定Bax、Bcl-2 海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞切片后常溫脫蠟加入3%甲醇溶液，常溫下山羊血清封閉20 min，加入兔抗Bax單抗及兔抗Bcl-2單抗，置濕盒4℃過夜，生物素標(biāo)記二抗，室溫下靜置10 min，加入辣根過氧化酶，室溫下靜止10 min，滴入DAB顯色劑，室溫顯色5～10 min，中性樹脂封片。以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色染色為Bax陽(yáng)性、Bcl-2陽(yáng)性。

1.4.5 ELISA法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞活性物質(zhì) 剝離大鼠海馬組織后迅速置于液氮中冷卻后研磨制備勻漿，3 000 r/min離心3 min半徑5 cm后留取懸浮物，應(yīng)用ELISA法測(cè)定勻漿NT、NGF、BDNF及Ach水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間水迷宮測(cè)試 實(shí)驗(yàn)第1天氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利組各時(shí)間段逃避潛伏期時(shí)間均短于氯胺酮組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax及Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞比較 氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(P<0.05)，而氯胺酮組均高于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間水迷宮測(cè)試

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與氯胺酮組比較:2)P<0.05；下表同

表2 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax及Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞比較，個(gè)/視野，n=10)

2.3 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞活性物質(zhì)水平比較 氯胺酮組海馬勻漿中NT、NGF、BD-NF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利組均低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞活性物質(zhì)水平比較

3 討 論

外科全麻后可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損傷，表現(xiàn)為記憶衰退。氯胺酮屬于N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，目前研究表明〔5〕，氯胺酮對(duì)記憶功能的損害作用可能與其促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及抑制神經(jīng)活性物質(zhì)表達(dá)有關(guān)。屈瀚等〔6〕認(rèn)為氯胺酮可抑制Ach合成限速酶活性從而降低海馬區(qū)Ach表達(dá)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。劉德君等〔7〕認(rèn)為氯胺酮對(duì)大鼠認(rèn)知功能損傷的主要原因與其促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡有關(guān)，外源性給予大鼠NMDA受體拮抗劑可有效保護(hù)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，改善大鼠認(rèn)知功能。阿米洛利屬于保鉀利尿劑，它可通過阻滯多種離子通道如酸感受離子通道、Na+/Ca2+交換泵等參與機(jī)體多項(xiàng)生命活動(dòng)〔8〕。研究指出〔9〕，阿米洛利對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有明顯的改善作用，它可以降低腦組織損傷后細(xì)胞內(nèi)Na+濃度，抑制Ca2+超載，降低游離脂肪酸及磷脂酶活性，減輕細(xì)胞組織水腫，抑制中性粒細(xì)胞聚集及細(xì)胞凋亡，改善腦組織血流及神經(jīng)功能損傷。本研究結(jié)果提示氯胺酮可損傷大鼠認(rèn)知功能。而且對(duì)氯胺酮麻醉大鼠給予阿迷洛利能有效減輕高濃度氯胺酮對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的損害。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬是與認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)等結(jié)構(gòu)有關(guān)，海馬神經(jīng)元參與長(zhǎng)期記憶過程，神經(jīng)元間主要通過神經(jīng)遞質(zhì)釋放及轉(zhuǎn)移完成相關(guān)信息傳遞及加工過程，當(dāng)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性、凋亡后會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳遞功能異常而影響記憶功能〔10〕。Bax、Bcl-2蛋白是與神經(jīng)元相關(guān)凋亡蛋白，當(dāng)神經(jīng)元Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，則提示海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量增加〔11〕。本研究結(jié)果提示氯胺酮麻醉大鼠記憶功能的損傷可能與氯胺酮可促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bax、Bcl-2蛋白水平有關(guān)。而且對(duì)氯胺酮麻醉大鼠給予阿米洛利可有效抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，拮抗Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，從而減輕大鼠麻醉后認(rèn)知功能的損傷。NT、NGF、BD-NF等神經(jīng)活性物質(zhì)在促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)及修復(fù)受損神經(jīng)元中起到重要的作用，而Ach是腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與記憶及學(xué)習(xí)能力有密切的關(guān)系，其含量多少與學(xué)習(xí)記憶能力有直接的關(guān)系〔12〕。本研究結(jié)果提示阿米洛利除了抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡外，還可通過上調(diào)神經(jīng)活性物質(zhì)水平而起到改善大鼠認(rèn)知功能的作用。

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〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃(No.14A320003)

李新帥(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事麻醉與鎮(zhèn)痛研究。

R614

A

1005-9202(2017)13-3150-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.012