李新帥

(南陽市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽 473000)

阿米洛利對氯胺酮麻醉大鼠神經(jīng)細胞凋亡及神經(jīng)細胞活性物質(zhì)的影響

李新帥

(南陽市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽 473000)

目的 探討阿米洛利對氯胺酮麻醉大鼠神經(jīng)細胞凋亡及神經(jīng)細胞活性物質(zhì)的影響。方法 選取60只成年雄性SD大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠分為生理鹽水5 ml·kg-1·h-1組(對照組)、氯胺酮組40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1組，每組20只，每天持續(xù)靜脈注射2 h，連續(xù)給藥7 d，最后1次給藥24 h后應用Morris水迷宮測試各組大鼠空間記憶能力。水迷宮試驗結束后處死各組大鼠取出腦海馬組織，分別應用TUNEL法及免疫組化法檢測神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)及Bax、Bcl-2表達，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定海馬組織勻漿中神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及乙酰膽堿(Ach)水平。結果 實驗第1天氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏時間顯著長于對照組(P<0.05)，隨著實驗時間延長，氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏期時間顯著延長(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利組各時間段逃避潛伏期時間均短于氯胺酮組(P<0.05)。氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽性細胞數(shù)量均高于對照組(P<0.05)，而氯胺酮組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽性細胞數(shù)量均高于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)。氯胺酮組海馬勻漿中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利組海馬勻漿中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于對照組(P<0.05)。結論 阿米洛利對氯胺酮麻醉后認知功能障礙的改善可能與其抑制神經(jīng)細胞凋亡及調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞活性物質(zhì)水平有關。

阿米洛利；氯胺酮；神經(jīng)細胞凋亡；神經(jīng)細胞活性物質(zhì)

術后認知功能障礙是外科全麻手術患者常見的并發(fā)癥，患者表現(xiàn)為記憶功能下降及認知功能損傷〔1〕。氯胺酮麻醉后認知功能障礙發(fā)生率較高，目前認為與氯胺酮降低腦組織中神經(jīng)細胞活性物質(zhì)促使炎癥介質(zhì)釋放而誘發(fā)神經(jīng)元損傷有關〔2〕。阿米洛利屬于保鉀利尿藥物，除了能阻斷鈉離子通道外，同時對神經(jīng)中樞多種離子通道有明顯的阻滯效果〔3〕。由于阿米洛利可通過阻滯鈉離子通道從而參與神經(jīng)病理調(diào)節(jié)過程，減輕酸化及缺血灌注所致的神經(jīng)元損傷，因此對神經(jīng)元功能具有保護作用〔4〕。本研究探討阿米洛利對氯胺酮麻醉大鼠認知功能的保護作用及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取60只成年雄性SD大鼠，重量180～200 g，購于河南省醫(yī)學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK(豫)2014-0008。所有大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度設定為20℃～25℃，濕度控制在60%～70%，燈光晝夜節(jié)律控制(8：00～20：00)。

1.2 主要試劑 復方鹽酸阿米洛利片(蘇州東瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字H10900015)；鹽酸氯胺酮注射液(西安漢豐藥業(yè)有限責任公司，批準文號：國藥準字H20054748)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司；批準文號：國藥準字H20056626)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗鼠Bax一抗(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠Bcl-2一抗(上海康朗生物科技有限公司)；羊抗兔二抗(南京生興生物技術有限公司)；神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；神經(jīng)生長因子(NGF)試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術有限公司)；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司)；乙酰膽堿(Ach)試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)。

1.3 主要儀器 手術器械(上海醫(yī)療器械設備廠)；超聲波清洗儀(型號：SKE-5S；寧波科麥儀器有限公司)；微量加樣器(北京華儀三譜儀器有限責任公司)；電子分析天平(型號：BT125D；賽多利斯儀器有限公司)；秒表(型號：AMP-ZSD-013；北京西化儀科技有限公司)；Morris水迷宮測試儀(北京北廣精儀儀器設備有限公司)；電子顯微鏡(深圳電子顯微鏡生產(chǎn)有限公司)；電熱恒溫箱(邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司)；切片機(威士達精密機械有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及建立氯胺酮麻醉大鼠模型 根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠分為生理鹽水組(對照組)、氯胺酮組(氯胺酮組)，氯胺酮+阿米洛利組，每組20只。所有大鼠均行尾部靜脈注射，對照組注射生理鹽水5 ml·kg-1·h-1，氯胺酮組緩慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮+阿米洛利組緩慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1，上述各組大鼠每天恒速輸注2 h，持續(xù)7 d。靜脈輸注過程中密切留意大鼠呼吸強度，并適時調(diào)整輸注速度，維持呼吸頻率>50次/min，麻醉過程中觀察氣血，排除血氣異常大鼠，剔除給藥過程中死亡的大鼠，余下大鼠于固定時間開始水迷宮測試。

1.4.2 水迷宮實驗測試 分別于實驗第1、3、5、7天從每組中選出10只大鼠進行水迷宮實驗，水迷宮由直徑130 cm×高50 cm的圓形水池組成，水深30 cm，池水恒溫，池壁上標有東南西北4個入水點，可將水池分SW、NW、SE、NE等4個象限，在NW象限中央離池壁33 cm處放置直徑9 cm×高29 cm的圓形透明平臺，并浸沒于水下。在池壁周圍貼上參照線供大鼠定位平臺，并在迷宮上方安裝攝像頭，記錄大鼠行程，訓練期間迷宮外參照物保持不變。在正式實驗前對大鼠進行2次預實驗，第1次將大鼠置于水池邊，讓大鼠在180 s內(nèi)套上高臺，如在規(guī)定時間內(nèi)大鼠未能上高臺，研究人員將引導大鼠，將其置于高臺10 s，相隔5 min后再對大鼠進行培訓。第2次培訓結束5 min后進行決定性實驗，在水下放置高臺，讓實驗大鼠在同一水平線出發(fā)登上高臺，記錄各組大鼠平均逃避潛伏期。

1.4.3 海馬神經(jīng)元細胞凋亡檢測 水迷宮試驗結束24 h后處死各組大鼠取出腦海馬組織，經(jīng)甲醛固定，乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，在視交叉海馬區(qū)行冠狀切片，切片厚度為5 μm。應用TUNEL法檢測大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)，以胞體縮小及細胞核呈棕黃色等形態(tài)學特征判斷海馬神經(jīng)元細胞凋亡，并隨機選取海馬區(qū)5個高倍視野(×500)，計算海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)。

1.4.4 免疫組化法測定Bax、Bcl-2 海馬區(qū)神經(jīng)元細胞切片后常溫脫蠟加入3%甲醇溶液，常溫下山羊血清封閉20 min，加入兔抗Bax單抗及兔抗Bcl-2單抗，置濕盒4℃過夜，生物素標記二抗，室溫下靜置10 min，加入辣根過氧化酶，室溫下靜止10 min，滴入DAB顯色劑，室溫顯色5～10 min，中性樹脂封片。以細胞核中出現(xiàn)棕黃色染色為Bax陽性、Bcl-2陽性。

1.4.5 ELISA法測定神經(jīng)細胞活性物質(zhì) 剝離大鼠海馬組織后迅速置于液氮中冷卻后研磨制備勻漿，3 000 r/min離心3 min半徑5 cm后留取懸浮物，應用ELISA法測定勻漿NT、NGF、BDNF及Ach水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行正態(tài)分布檢驗、t檢驗、方差齊性檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠不同時間水迷宮測試 實驗第1天氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏時間顯著長于對照組(P<0.05)，隨著實驗時間延長，氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組逃避潛伏期時間顯著延長(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利組各時間段逃避潛伏期時間均短于氯胺酮組(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)、Bax及Bcl-2陽性細胞比較 氯胺酮組、氯胺酮+阿米洛利組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)、Bax、Bcl-2陽性細胞數(shù)量均高于對照組(P<0.05)，而氯胺酮組均高于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠不同時間水迷宮測試

與對照組比較:1)P<0.05；與氯胺酮組比較:2)P<0.05；下表同

表2 各組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)、Bax及Bcl-2陽性細胞比較，個/視野，n=10)

2.3 各組大鼠神經(jīng)元細胞活性物質(zhì)水平比較 氯胺酮組海馬勻漿中NT、NGF、BD-NF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利組(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利組均低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)元細胞活性物質(zhì)水平比較

3 討 論

外科全麻后可導致患者認知功能損傷，表現(xiàn)為記憶衰退。氯胺酮屬于N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體非競爭性抑制劑，目前研究表明〔5〕，氯胺酮對記憶功能的損害作用可能與其促進海馬神經(jīng)元細胞凋亡及抑制神經(jīng)活性物質(zhì)表達有關。屈瀚等〔6〕認為氯胺酮可抑制Ach合成限速酶活性從而降低海馬區(qū)Ach表達，導致認知功能障礙。劉德君等〔7〕認為氯胺酮對大鼠認知功能損傷的主要原因與其促進神經(jīng)元細胞大量凋亡有關，外源性給予大鼠NMDA受體拮抗劑可有效保護大鼠神經(jīng)元細胞，改善大鼠認知功能。阿米洛利屬于保鉀利尿劑，它可通過阻滯多種離子通道如酸感受離子通道、Na+/Ca2+交換泵等參與機體多項生命活動〔8〕。研究指出〔9〕，阿米洛利對神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有明顯的改善作用，它可以降低腦組織損傷后細胞內(nèi)Na+濃度，抑制Ca2+超載，降低游離脂肪酸及磷脂酶活性，減輕細胞組織水腫，抑制中性粒細胞聚集及細胞凋亡，改善腦組織血流及神經(jīng)功能損傷。本研究結果提示氯胺酮可損傷大鼠認知功能。而且對氯胺酮麻醉大鼠給予阿迷洛利能有效減輕高濃度氯胺酮對大鼠學習、記憶功能的損害。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬是與認知、記憶、學習等結構有關，海馬神經(jīng)元參與長期記憶過程，神經(jīng)元間主要通過神經(jīng)遞質(zhì)釋放及轉移完成相關信息傳遞及加工過程，當海馬區(qū)神經(jīng)細胞變性、凋亡后會導致信號傳遞功能異常而影響記憶功能〔10〕。Bax、Bcl-2蛋白是與神經(jīng)元相關凋亡蛋白，當神經(jīng)元Bax、Bcl-2蛋白表達水平升高，則提示海馬區(qū)細胞凋亡數(shù)量增加〔11〕。本研究結果提示氯胺酮麻醉大鼠記憶功能的損傷可能與氯胺酮可促使神經(jīng)元細胞凋亡，上調(diào)Bax、Bcl-2蛋白水平有關。而且對氯胺酮麻醉大鼠給予阿米洛利可有效抑制神經(jīng)元細胞凋亡，拮抗Bax、Bcl-2蛋白表達，從而減輕大鼠麻醉后認知功能的損傷。NT、NGF、BD-NF等神經(jīng)活性物質(zhì)在促進神經(jīng)元細胞生長及修復受損神經(jīng)元中起到重要的作用，而Ach是腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與記憶及學習能力有密切的關系，其含量多少與學習記憶能力有直接的關系〔12〕。本研究結果提示阿米洛利除了抑制神經(jīng)元細胞凋亡外，還可通過上調(diào)神經(jīng)活性物質(zhì)水平而起到改善大鼠認知功能的作用。

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〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

河南省科技廳科技發(fā)展計劃(No.14A320003)

李新帥(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事麻醉與鎮(zhèn)痛研究。

R614

A

1005-9202(2017)13-3150-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.012