王 麗 方玉甫 耿慶娜 周國秀 王雪峰

(河南省中醫(yī)院皮膚科 河南中醫(yī)藥大學(xué)皮膚性病研究所，河南 鄭州 450002)

自擬中藥復(fù)方對(duì)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠脊髓背角iNOS表達(dá)的影響

王 麗 方玉甫 耿慶娜1周國秀 王雪峰2

(河南省中醫(yī)院皮膚科 河南中醫(yī)藥大學(xué)皮膚性病研究所，河南 鄭州 450002)

目的 通過建立水痘帶狀皰疹病毒慢性感染的帶狀皰疹后神經(jīng)痛大鼠模型，研究自擬中藥復(fù)方對(duì)帶狀皰疹后神經(jīng)痛模型大鼠脊髓背角iNOS表達(dá)的影響。方法 利用水痘帶狀皰疹病毒慢性感染大鼠，建立帶狀皰疹后神經(jīng)痛動(dòng)物模型?？瞻讓?duì)照組(大鼠左趾璞注射同等劑量的生理鹽水)、模型對(duì)照組、自擬方高劑量組、自擬方低劑量組。各組大鼠分別于給藥前1 d、給藥開始后第4、7、14天檢測(cè)大鼠機(jī)械縮爪閾值、熱刺激縮爪潛伏期；末次測(cè)量完成后，取各大鼠L4 ～ L6 脊髓組織進(jìn)行RT-PCR、Western印跡和免疫組化。結(jié)果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的MWT、PWL值明顯低于對(duì)照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組MWT、PWL值第4、7、14天均比對(duì)照組明顯降低；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組MWT、PWL值與模型組相比均明顯升高，高劑量組在第14天MWT、PWL值與模型組相比明顯升高。模型組PWL值iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高；自擬方高低劑量組iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平與模型組相比均降低，高劑量組iNOS mRNA水平與模型組相比明顯降低。結(jié)論 自擬中藥方對(duì)帶狀皰疹后神經(jīng)痛模型大鼠痛覺行為有改善作用，其機(jī)制可能與下調(diào)iNOS在脊髓背角的表達(dá)有關(guān)。

帶狀皰疹后神經(jīng)痛；水痘帶狀皰疹病毒；脊髓背角；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制目前尚在研究中，目前主要認(rèn)為帶狀皰疹由病毒引起，且該病毒具有嗜神經(jīng)性，人受到水痘帶狀皰疹病毒感染(VZV)后，該病毒能一直潛伏在神經(jīng)節(jié)內(nèi)，當(dāng)人體免疫力低下或免疫功能受到抑制時(shí)就會(huì)激活該病毒，從而引起一種特征性、區(qū)域性、劇烈疼痛性的皮疹〔1～4〕，是神經(jīng)損傷后周邊和中樞的敏感化帶來的灼燒痛、銳痛和異常性疼痛。目前臨床上尚缺乏行之有效的治療方案，中藥的整體調(diào)節(jié)與標(biāo)本兼治的作用可減輕患者的痛苦。多項(xiàng)研究顯示PHN的發(fā)生與脊髓背角誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的過表達(dá)密切相關(guān)〔5，6〕，本方中細(xì)辛等的鎮(zhèn)痛作用與其減少iNOS的表達(dá)有關(guān)〔7〕。本研究擬探討自擬中藥方對(duì)PHN模型大鼠脊髓背角iNOS表達(dá)的影響，探討該方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)成年SD 大鼠，雄性，購自河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院〔SYXK(豫)2013～0008〕，體重 200～220 g，共48只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，控制室溫為18～26℃，溫差在4℃以內(nèi)；相對(duì)濕度40%～70%，晝夜各12 h；所有動(dòng)物在整個(gè)飼養(yǎng)過程中自由飲食與活動(dòng)，其余飼養(yǎng)條件均符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010中的規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 Trizol總RNA提取試劑：Invitrogen公司；組織RNA提取試劑盒：Omega公司；cDNA合成試劑盒：TaKaRa公司； PCR擴(kuò)增試劑盒：Taq公司;BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：Beyontime公司；iNOS 1抗：Abcam公司; BME-410A型熱痛刺激儀：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.3 動(dòng)物模型復(fù)制 按照文獻(xiàn)〔8〕方法利用水痘帶狀皰疹病毒慢性感染大鼠，建立帶狀皰疹后神經(jīng)痛動(dòng)物模型。首先將CV-1細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基(DMEM/F12)中制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5×104/cm2的濃度接種于培養(yǎng)瓶中，然后用VZV 感染CV-1細(xì)胞。約有80%的細(xì)胞被感染時(shí)(約2 d后)，收集被感染細(xì)胞于PBS中制成病毒接種細(xì)胞懸液，最后濃度約為12×106個(gè)/100 μl的病毒接種液注入SD大鼠左趾璞，每只50 μl。VZV感染后3～4 d大鼠開始出現(xiàn)熱痛敏閾值和機(jī)械痛敏閾值異?？膳卸槟Ｐ蛷?fù)制成功，選取成功的動(dòng)物納入分組。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 除10只大鼠為空白對(duì)照組(大鼠左趾璞注射同等劑量的 生理鹽水)外，余大鼠均進(jìn)行造模，造模成功的大鼠中選取30只分為模型對(duì)照組、自擬方高劑量組、自擬方低劑量組，每組10只。帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛自擬中藥方主要組成：黃芪20 g，丹參20 g，川芎12 g，元胡20 g，徐長(zhǎng)卿20 g，川楝子15 g，細(xì)辛3 g，地龍10 g，等；以上方藥按臨床用量與動(dòng)物體重關(guān)系換算為高劑量及低劑量，煎煮過濾藥渣后，藥液灌胃給藥；空白對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠分別于給藥前1 d、給藥開始后第4、7、14天檢測(cè)大鼠機(jī)械縮爪閾值、熱刺激縮爪潛伏期，均在每天上午相同時(shí)間進(jìn)行；末次測(cè)量完成后，取各大鼠L4～L6脊髓組織進(jìn)行RT-PCR、Western印跡和免疫組化。

1.5.1 機(jī)械縮爪閾值(MWT) 測(cè)定 即50%縮爪閾值。各組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間以von Frey纖維(美國 Stoelting 公司)測(cè)定機(jī)械痛閾。采用up-and-down的方法測(cè)定大鼠50%縮爪閾值。由弱到強(qiáng)刺激每只大鼠足底，每個(gè)刺激強(qiáng)度重復(fù)10次，出現(xiàn)5次以上縮足反射的陽性反應(yīng)時(shí)，即可完成50%縮爪閾值的測(cè)定。5 MWT按50%閾值(g)=10logXf + k?/10 000進(jìn)行計(jì)算，公式中Xf是指最后刺激所用力度，k是指不同刺激方式的系數(shù)，?是指各刺激力度的對(duì)數(shù)值值相鄰間距的平均數(shù)，在本實(shí)驗(yàn)中?=0.186。

1.5.2 熱刺激縮爪潛伏期(PWL)測(cè)定 各組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間用BME-410A型熱痛刺激儀測(cè)定PWL值。將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機(jī)玻璃箱中，大鼠適應(yīng)15 min后，用熱輻射刺激儀發(fā)出的5 mm光斑照射大鼠足底，從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間記錄為PWL，照射時(shí)間在30 s內(nèi)，因此最長(zhǎng)記為30 s。每只大鼠同樣操作測(cè)量5次，每次間隔10 min，去掉最小值和最大值，余3次的平均值為每只大鼠的PWL值。

1.5.3 iNOS mRNA表達(dá)測(cè)定 大鼠麻醉后取L4～L6脊髓組織在潔凈操作臺(tái)上于勻漿器中加入液氮研磨后，加入Trizol進(jìn)行裂解，采用RNA提取試劑盒分離提取總mRNA?？俶RNA濃度測(cè)定符合要求后，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA模板并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。測(cè)定iNOS mRNA的表達(dá)水平。RT-PCR 引物序列：iNOS：正義鏈：5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′，反義鏈：5′-GGGTGTCAGAGTCTTGTGCCTTTGG-3′。

1.5.4 iNOS蛋白表達(dá)測(cè)定 取 L4～L6脊髓組織于細(xì)胞裂解緩沖液中勻漿，分離提取總蛋白溶液?？偟鞍诐舛葴y(cè)定符合要求后，蛋白于SDS-PAGE膠上電泳分離轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉，4℃Ⅰ抗(1∶1 000)孵育過夜，PBS洗膜3次，Ⅱ抗(1∶5 000) 孵育1 h，PBS洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。計(jì)算分析平均灰度值。

1.5.5 免疫組織化學(xué)觀察 取 L4～L6脊髓組織切片PBS后漂洗3次，iNOS 一抗(1∶200，Calbiochem，USA) 孵育過夜，PBS洗3次；二抗(1∶400)孵育6 h，PBS洗3次。經(jīng)脫水、透明后石蠟包埋制片，常規(guī)染色，在顯微鏡下觀察所取組織的形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件，符合正態(tài)分布的進(jìn)行成組設(shè)計(jì)方差分析，組內(nèi)均數(shù)差異比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MWT測(cè)定結(jié)果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的MWT值明顯低于對(duì)照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組MWT值第4、7、14天均比對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組MWT值與模型組相比均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，高劑量組在第14天MWT值與模型組相比明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.2 PWL測(cè)定結(jié)果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的PWL值明顯低于對(duì)照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組PWL值第4、7、14天均比對(duì)照組明顯降低(P<0.05,P<0.01)；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組PWL值與模型組相比均升高(P<0.05,P<0.01)，高劑量組在第14天PWL值與模型組相比明顯升高(P<0.01)。見表2。

2.3 免疫組化結(jié)果 棕黃色顆粒沉淀為iNOS陽性表達(dá)，對(duì)照組棕黃色顆粒沉淀少見，可見對(duì)照組脊髓背角iNOS未見過度表達(dá)；模型組可見棕黃色顆粒沉淀較多密度較大，可見模型組脊髓背角iNOS過表達(dá)；而給予自擬方高、低劑量干預(yù)后，棕黃色顆粒沉淀減少，iNOS表達(dá)下降。見圖1。

表1 各組大鼠給藥前、后MWT值的變化

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 各組大鼠給藥前、后PWL值的變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

圖1 iNOS在各組大鼠脊髓背角中的表達(dá)(DAB，×400)

2.4 iNOS在各組大鼠脊髓背角中的表達(dá) 模型組iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)；自擬方高低劑量組iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平與模型組相比均降低(P<0.05,P<0.01)，高劑量組iNOS mRNA表達(dá)水平與模型組相比明顯降低(P<0.01)。見表3，圖2、圖3。

表3 自擬方對(duì)VZV大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖2 自擬方對(duì)VZV大鼠脊髓背角iNOS mRNA表達(dá)的影響

圖3 自擬方對(duì)VZV大鼠脊髓背角iNOS 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

帶狀皰疹常因延誤治療而帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥，即使發(fā)現(xiàn)后給予及時(shí)的抗病毒治療，PHN的發(fā)生率仍然較高。人體初次感染水痘-帶狀皰疹病毒，雖然通常發(fā)生在童年時(shí)期，但VZV 具有嗜神經(jīng)性，容易沿著軸突逆行轉(zhuǎn)運(yùn)并靜息、潛伏于感覺神經(jīng)節(jié)。老年人容易發(fā)生免疫功能生理性減退或由于腫瘤、自身免疫性疾病、感染、器官移植排斥反應(yīng)等使得免疫系統(tǒng)受抑制時(shí)，VZV可能被重新激活，大量復(fù)制后沿軸突轉(zhuǎn)運(yùn)到人體表層即皮膚，而產(chǎn)生皰疹，產(chǎn)生神經(jīng)性急性疼痛。目前治療急、慢性疼痛藥物常用的有阿片肽類藥物、辣椒素受體抑制劑、抗抑郁藥、局麻藥和類固醇類等，但對(duì) PHN 的療效不佳；對(duì)于大部分老年人患者，自身免疫功能降低，且常有心腦血管功能、呼吸系統(tǒng)功能、內(nèi)分泌功能等異常性疾病合并發(fā)生，大劑量的上述藥物可能帶來更嚴(yán)重的藥物副作用而給生命帶來危害。合適的動(dòng)物模型是研究PHN發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及藥物作用機(jī)制的重要橋梁。Guedon等〔9〕成功建立了 VZV 慢性感染的PHN動(dòng)物模型。研究者將感染 VZV 的 CV-1 細(xì)胞經(jīng)過皮下注射于大鼠左趾蹼，3～4 d后成功感染的大鼠會(huì)開始出現(xiàn)痛覺異常，2 w左右痛覺閾值達(dá)到最低值，該效應(yīng)至少持續(xù)7～8 w，14 w左右可恢復(fù)到基線水平，這些表現(xiàn)與臨床上患者 PHN 的發(fā)生、發(fā)展與消退過程十分相似。因此，該模型成為目前運(yùn)用最多的并被大多數(shù)研究者認(rèn)為是用于研究PHN 相對(duì)可靠的模型。本研究發(fā)現(xiàn)造模后，模型組的痛覺行為MWT、PWL值均明顯降低，且在14 d差異更加顯著。提示VZV感染后疼痛模型復(fù)制成功。

免疫力低下、周圍神經(jīng)纖維以及末梢發(fā)生炎癥和變性，是目前認(rèn)為PHN發(fā)病的主要原因，而脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)與其發(fā)生也有密切關(guān)系〔10〕。有學(xué)者發(fā)現(xiàn) PHN 病人的脊髓背角、前扣帶回皮質(zhì)等參與痛覺信息調(diào)控的中樞中，相關(guān)的核團(tuán)或腦區(qū)呈現(xiàn)出過度代謝和激活狀態(tài)〔11〕。脊髓背角可能起著至為關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)其上的iNOS過表達(dá)可能參與PHN的發(fā)生與進(jìn)程〔4〕。一氧化氮(NO) 作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞及外周不同程度的痛覺調(diào)制，在脊髓更顯示出起著極其重要的作用〔12〕。外周神經(jīng)損傷可見脊髓背角NOS 的過度表達(dá)；而給予全身或鞘內(nèi)注射NOS 抑制劑則可對(duì)神經(jīng)病理性痛起到良好的鎮(zhèn)痛作用，有研究結(jié)果顯示NOS三個(gè)亞型中只有 iNOS 參與了PHN 的形成和維持。在本研究中，模型組大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白均處于表達(dá)狀態(tài)，顯示出iNOS與VZV誘導(dǎo)的PHN模型密切相關(guān)。而給予自擬中藥方干預(yù)后大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平均下降，而痛覺行為MWT、PWL值也升高，且以高劑量較為顯著。自擬方以黃芪、丹參等調(diào)解免疫系統(tǒng)，以川芎、元胡、細(xì)辛、徐長(zhǎng)卿、川楝子等緩解疼痛，川芎〔13〕、細(xì)辛〔7〕、元胡〔14〕等均有研究報(bào)道能通過下調(diào)神經(jīng)或組織iNOS表達(dá)水平而起到鎮(zhèn)痛作用，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)本研究中的中藥復(fù)方臨床用于治療PHN的機(jī)制可能通過下調(diào)iNOS信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

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〔2016-10-15修回〕

(編輯 徐 杰)

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目資助計(jì)劃(14A320056)；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(2013ZY04036)

王 麗(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病、性病方面研究。

R752.1+2

A

1005-9202(2017)13-3145-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.010

1 開封市第二人民醫(yī)院皮膚科 2 河南省中醫(yī)院康復(fù)科