肖 芳 吳 琦

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000)

枸杞多糖在白血病患者中的應(yīng)用及對HL-60和NK細(xì)胞殺傷活性的影響

肖 芳 吳 琦1

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000)

目的 探討枸杞多糖在白血病患者中的應(yīng)用及對人前髓細(xì)胞HL-60表面靶細(xì)胞表面相應(yīng)配體(MICA)蛋白表達(dá)水平和自然殺傷(NK)細(xì)胞殺傷活性的影響及機(jī)制。方法 取白血病患者HL-60細(xì)胞，隨機(jī)分為觀察1組、觀察2組及觀察3組，分別放入濃度為6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培養(yǎng)，未經(jīng)枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60細(xì)胞為對照組，采用流式細(xì)胞儀測定4組細(xì)胞表面MICA蛋白表達(dá)水平。將4組獲得的溶液與NK細(xì)胞相互混合，20 h后采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測NK細(xì)胞對4組HL-60細(xì)胞的殺傷活性進(jìn)行測定。結(jié)果 觀察1組MICA表達(dá)率顯著低于觀察2組、觀察3組(P<0.05)；觀察1組、觀察2組、觀察3組MICA表達(dá)率高于對照組(P<0.05)；隨著靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞比的不斷增加，4組NK細(xì)胞殺傷活性均出現(xiàn)上升趨勢；觀察1組、觀察2組及觀察3組NK細(xì)胞殺傷活性高于對照組(P<0.05)；觀察3組NK細(xì)胞殺傷活性，高于觀察1組、觀察2組(P<0.05)。結(jié)論 白血病患者體內(nèi)HL-60細(xì)胞在枸杞多糖的孵育下能提高細(xì)胞MICA表達(dá)率，且呈濃度正相關(guān)性。同時(shí)，枸杞多糖能提高機(jī)體內(nèi)NK細(xì)胞的殺傷活性，能清除微小病灶。

枸杞多糖；白血病；HL-60細(xì)胞；MICA表達(dá)率；自然殺傷細(xì)胞；殺傷活性

自然殺傷(NK)細(xì)胞屬于人體的免疫細(xì)胞，是機(jī)體的第一道防御屏障，在抑制腫瘤的生長、增殖中發(fā)揮重要的作用，其殺傷活性與細(xì)胞表面受體、靶細(xì)胞表面配體關(guān)系密切〔1〕。白血病屬于血液性腫瘤，死亡率、復(fù)發(fā)率較高〔2〕。目前，臨床上對于白血病以化療、異基因造血干細(xì)胞抑制治療為主。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，以NK細(xì)胞活化受體與配體(MICA-NKG2D)靶向治療在白血病患者中得到應(yīng)用，該方法采用MICA抗體封閉的白血病細(xì)胞株能提高NK細(xì)胞殺傷作用，治療效果更加敏感。白血病患者與NK細(xì)胞敏感性關(guān)系表明〔3〕，MICA對腫瘤具有生長抑制作用，能激發(fā)NK細(xì)胞和T細(xì)胞免疫。但是，人體中NK細(xì)胞數(shù)量相對較少，在外周淋巴細(xì)胞中僅占5%～15%。枸杞中含有植物多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，能發(fā)揮“補(bǔ)益精氣”等功效。文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞多糖中含有多種耐藥逆轉(zhuǎn)活性物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能殺死腫瘤細(xì)胞，提高機(jī)體免疫和細(xì)胞殺傷活性，但是該結(jié)論尚未得到進(jìn)一步證實(shí)。本文旨在探討枸杞多糖在白血病患者中的應(yīng)用及對人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)表面MICA蛋白表達(dá)水平和NK細(xì)胞殺傷活性的影響及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 于2014年1月至2016年6月取90例白血病患者HL-60細(xì)胞，隨機(jī)分為觀察1組、觀察2組及觀察3組，每組30例。其中男54例，女36例，年齡15～74〔平均(32.6±2.5)〕歲。未經(jīng)枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60細(xì)胞為對照組。其中男18例，女12例，年齡16～75〔平均(33.1±2.7)〕歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合白血病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)生化指標(biāo)檢驗(yàn)，病理學(xué)測定確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有影響效應(yīng)指標(biāo)觀測、判斷其他生理或病理者；②合并嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者；③合并傳染性疾病及意識不清或存在精神障礙者。

1.2 儀器及試劑 RPMI-1640粉劑(美國Gibco公司)；枸杞多糖(純度98%)(寧夏紫金花藥業(yè)股份有限公司)；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(美國eBioscience公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO牌)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Olympus倒置顯微鏡(OlympuS公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)；WellscanMK3酶標(biāo)儀(Labsystems Dragon公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) ①HL-60培養(yǎng)。將分離獲得的HL-60放置在濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基顏色的變化，每3 d換液1次，600 r/min離心5 min，去除上層清液采用吸管吹打混合均勻后添加完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。采集細(xì)胞，600 r/min離心5 min，去除上層清液。調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml，分別加入濃度為6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)立對照孔。48 h后收集細(xì)胞，1 200 r/min離心10 min，用于測定各組MICA表達(dá)率。②NK細(xì)胞培養(yǎng)。將獲得的NK細(xì)胞接種在濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基顏色的變化，每4～5 d換液1次，800 r/min離心10 min，去除上層清液，采用尖吸管吹打混合后加入完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。③混合培養(yǎng)。將HL-60作為靶細(xì)胞，加入濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度1×104/ml接種在96孔板中，每孔50 μl，以NK作為效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞比5∶1、10∶1、20∶1調(diào)整細(xì)胞濃度，混合后放入37℃、5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置單細(xì)胞靶孔為對照組〔5〕。

1.3.2 HL-60表面MICA表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷活性測定 (1)MICA表達(dá)。采集3種經(jīng)枸杞多糖作用后的HL-6，放入離心管中，1 200 r/min離心10 min，去除上層清液，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，分管后每管加入1×106/0.1 ml細(xì)胞懸液，并加入MICA單抗，4℃下進(jìn)行30 min標(biāo)記，加入PBS洗滌液，1 500 r/min離心5 min，加入100 μl FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，4℃下進(jìn)行30 min標(biāo)記，加入PBS洗滌液洗滌2次，然后上流式細(xì)胞儀檢測，以對照管作為空白定標(biāo)，分析4組細(xì)胞中陽性細(xì)胞表達(dá)率〔6〕。(2)NK細(xì)胞殺傷活性測定。取枸杞多糖處理后的HL-60和NK細(xì)胞混合溶液，培養(yǎng)20 h后向每孔中加入10 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行24 h培養(yǎng)，使得沉淀充分溶解，采用WellscanMK3酶標(biāo)儀測定波長在570 nm下各孔的吸光度值〔9〕。細(xì)胞殺傷活性=〔1-(Ae+t-Ae)/At〕×100.0%。Ae+t：殺傷孔OD值；Ae為單純效應(yīng)細(xì)胞OD值；At單純靶細(xì)胞OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 4組HL-60 MICA表達(dá)水平比較 觀察1組MICA表達(dá)率〔(65.02±2.24)%〕顯著低于觀察2組〔(42.29±1.57)%〕、觀察3組〔(10.34±0.91)%〕(P<0.05)；觀察1組、觀察2組、觀察3組MICA表達(dá)率顯著高于對照組〔(6.34±0.81)%〕(P<0.05)。

表1 4組NK細(xì)胞殺傷活性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與觀察3組比較：2)P<0.05

2.2 4組NK細(xì)胞殺傷活性比較 見表1。隨著靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞比的不斷增加，4組NK細(xì)胞殺傷活性均出現(xiàn)上升趨勢；觀察1組、觀察2組及觀察3組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于對照組(P<0.05)；觀察3組NK細(xì)胞殺傷活性顯著高于觀察1組、觀察2組(P<0.05)。

3 討 論

目前，臨床上對于白血病多以大劑量聯(lián)合化療為主，該方法雖然能改善患者癥狀，但是長期療效欠佳，僅有不到40.0%患者能獲得長期生存，且患者5年生存率較低〔8〕。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫治療在白血病患者中得到應(yīng)用，該方法無論在原發(fā)性白血病還是復(fù)發(fā)性白血病患者中均能獲得較高的緩解率。免疫治療主要通過增強(qiáng)或抑制免疫功能對機(jī)體進(jìn)行有效的改善，從而能提高機(jī)體免疫干預(yù)，達(dá)到治療的目的。同時(shí)，免疫治療能有效清除殘余的惡性腫瘤，提高腫塊抗原免疫原性，從而提高機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答。體外研究顯示〔9〕，NK細(xì)胞對多種腫瘤具有細(xì)胞毒活性，能有效改善患者癥狀，延長患者壽命。但是人體中NK細(xì)胞數(shù)量相對較少，治療時(shí)長期療效欠佳，臨床需要采取有效的措施提高NK細(xì)胞數(shù)量。

為了進(jìn)一步提高NK細(xì)胞的殺傷活性，必須要降低抑制信號水平，提高激活信號水平，從而對沖抑制性信號，形成刺激性信號的強(qiáng)勢，最終殺滅腫瘤細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道〔10〕，通過藥物干預(yù)能有效提高腫瘤細(xì)胞表面mMICA表達(dá)水平，進(jìn)一步激活NK細(xì)胞對腫瘤的細(xì)胞殺傷活性，而sMICA對于機(jī)體抗腫瘤能發(fā)揮其負(fù)調(diào)節(jié)作用，是否存在藥物進(jìn)行有效的干預(yù)尚需要進(jìn)一步研究和探討。組蛋白取乙?；种苿┍焖徕c能有效提高肝癌表面的MICA水平，從而能有效提高NK細(xì)胞殺傷活性。患者用藥后機(jī)體內(nèi)的曲骨霉素A、維生素D3等均會隨著白血病細(xì)胞的上NKG2D配體表達(dá)。部分靶分子藥物能有效地提高腫瘤細(xì)胞的表達(dá)能力，直接作用在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)外源性凋亡途徑的多個(gè)靶點(diǎn)，從而能上調(diào)NK細(xì)胞活化受體的配體，能有效地提高腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞的殺傷敏感性。本研究結(jié)果提示枸杞多糖在白血病患者中能發(fā)揮重要的作用。

目前，枸杞多糖是臨床上常用的治療藥物，該藥物具有增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤等效應(yīng)，藥物能從降低抑制性信號水平、提高激活性信號水平，形成刺激性信號的強(qiáng)勢，從而殺死腫瘤細(xì)胞。國外學(xué)者研究顯示，枸杞多糖具有良好的抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等藥理作用〔4〕。本研究結(jié)果提示機(jī)體中MICA表達(dá)的提高能進(jìn)一步提高白血病細(xì)胞對于患者NK細(xì)胞的介導(dǎo)作用，能有效提高細(xì)胞殺傷能力，即MICA水平的高低決定了白血病患者治療效果及預(yù)后情況，通過采用枸杞多糖能有效提高患者M(jìn)ICA水平，從而能提高NK細(xì)胞殺傷活性，改善患者預(yù)后，促進(jìn)患者早期恢復(fù)，降低治療后復(fù)發(fā)率。因此，臨床上對于白血病的治療可以在患者身體狀況允許下適當(dāng)采用枸杞多糖，提高機(jī)體免疫，從而能有效改善患者癥狀，通過機(jī)體免疫殺死腫瘤，從而改善患者生存質(zhì)量，使得患者的治療更具針對性〔11〕。

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〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.10451008901001139)

肖 芳(1980-)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科血液病學(xué)研究。

R733.7

A

1005-9202(2017)13-3140-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.008

1 廣東醫(yī)科大學(xué)