方儀德 何祖燕 陳 丹 陳圣敏 楚 敏 隋 璐 董 楊

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

老年性聾小鼠認(rèn)知功能的下降及其機(jī)制

方儀德 何祖燕 陳 丹 陳圣敏 楚 敏 隋 璐 董 楊

(上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203)

目的 觀察C57BL/6J老年性聾小鼠認(rèn)知功能的改變并探討其機(jī)制。方法 雄性C57BL/6J小鼠分為3月齡(青年)組和12月齡(中年)組。聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)小鼠聽功能，Morris水迷宮觀察小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，Western印跡檢測(cè)小鼠海馬和聽皮層BDNF和p-TrkB的蛋白表達(dá)。結(jié)果 12月齡小鼠8、16、24 kHz和32 kHz的聽閾值與3月齡組比較明顯上升(P<0.01)，提示聽功能嚴(yán)重?fù)p失。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從訓(xùn)練的第3天開始直到第5天，12月齡組小鼠潛伏期均顯著高于3月齡組(P<0.01,P<0.05)，12月齡組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著低于3月齡組(P<0.01)。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與3月齡小鼠比較，12月齡小鼠海馬和聽皮層BDNF蛋白表達(dá)無明顯變化，p-TrkB蛋白表達(dá)降低。結(jié)論 12月齡C57BL/6J小鼠即顯示明顯的認(rèn)知功能下降，可能與其早發(fā)的老年性聾有一定關(guān)系，海馬和聽皮層TrkB蛋白的磷酸化可能是主要機(jī)制之一。

老年性聾;認(rèn)知功能;海馬;聽皮層

大量臨床觀察表明，聽力損失的患者更容易發(fā)展成為阿爾茨海默病(AD)或者其他類型的老年癡呆。有研究報(bào)道，癡呆者比非癡呆者的聽力障礙更多見，二者不僅相關(guān)，聽力下降程度與認(rèn)知障礙程度之間還存在著明顯的正相關(guān)，即聽力障礙越重，認(rèn)知障礙越重，使用助聽器能夠使認(rèn)知功能障礙改善〔1,2〕。Gates等〔3〕在進(jìn)行了大規(guī)模的臨床前瞻隊(duì)列研究后指出，中樞聽覺言語處理障礙中47%發(fā)展為AD失智型，而對(duì)照組中只4.6%，認(rèn)為聽力障礙可能是AD的早期癥狀。有學(xué)者在老年性聾模型C57BL/6J小鼠觀察到年齡相關(guān)的聽力損失伴隨空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降以及海馬CA3區(qū)突觸的退化，而無老年性聾的小鼠模型CBA/CaJ則無此特征〔4〕。雖然老年性聾與認(rèn)知功能障礙或老年癡呆等疾病相關(guān)的機(jī)制尚不清楚，但二者的關(guān)聯(lián)已經(jīng)被大量臨床研究證明確實(shí)存在，聽力障礙可以作為預(yù)測(cè)隨訪期間認(rèn)知功能是否下降的指標(biāo)，而對(duì)老年人聽力損失進(jìn)行早期干預(yù)有可能延緩老年癡呆的發(fā)生〔5,6〕。因此，探討老年性聾與認(rèn)知功能下降的關(guān)系及其機(jī)制有一定的臨床指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TDT-Ⅲ系統(tǒng)：美國Tucker-Davis-technologies公司； Ethovision XT動(dòng)物軌跡跟蹤及行為觀察記錄分析系統(tǒng)：荷蘭Noldus information technology公司；水平、垂直電泳及轉(zhuǎn)膜裝置：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 聽性腦干反應(yīng)(ABR) 記錄電極置于小鼠的顱頂，參考電極置于刺激側(cè)耳廓，地線接對(duì)側(cè)耳廓。采用TDT-Ⅲ系統(tǒng)測(cè)試，刺激聲為8,16,24，32 kHz的短純音，聲刺激從90 dB開始，5 dB遞減，以能分辨出ABR波形的刺激強(qiáng)度確定閾值。

1.2.2 Morris水迷宮 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間探索兩部分。將水迷宮均分為4個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段為5 d。每只小鼠每天接受2次訓(xùn)練，每次60 s，兩次訓(xùn)練間隔為30 s。如果小鼠在60 s內(nèi)上臺(tái)，則允許其在平臺(tái)停留30 s。如果小鼠在60 s內(nèi)不能找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并使其停留30 s，其潛伏期即為60 s(定位航行實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)第6天撤除平臺(tái)，分2次將小鼠放入水中，游泳時(shí)間60 s，記錄并分析小鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)(空間探索實(shí)驗(yàn))。

1.2.3 Western印跡 組織按照每20 mg/100 μl的比例加入裂解液，充分裂解后，離心，取上清。BCA法測(cè)蛋白濃度。樣品按40 μg樣品蛋白/孔上樣，12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)75 min(4℃，100 V)，5%脫脂奶粉室溫平搖封閉2 h，然后分別用GAPDH(1∶2 000)、BDNF(1∶200)和p-TrkB(1∶500)一抗4℃平搖過夜，HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)避光孵育2 h，采用ECL Plus顯色液顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PrismDemo5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 聽功能損傷 采用ABR檢測(cè)聽功能，見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12月齡小鼠8 kHz、16 kHz、24 kHz和32 kHz 的聽閾值與3月齡組比較均有明顯升高(P<0.01)，提示12月齡中年小鼠已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的聽功能損失。

與3月齡比較：1)P<0.01圖1 ABR檢測(cè)聽功能

2.2 空間和學(xué)習(xí)記憶能力下降 實(shí)驗(yàn)過程包括5 d的定位航行訓(xùn)練和1 d的空間探索實(shí)驗(yàn)，小鼠游泳軌跡見圖2A。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從訓(xùn)練的第3天開始，3月齡小鼠的潛伏期即有顯著的下降，而12月齡小鼠在5 d的訓(xùn)練過程中潛伏期沒有明顯變化。第3～5天，12月齡小鼠的潛伏期明顯高于3月齡小鼠(P<0.01,P<0.05)，見圖2B。經(jīng)過5 d的訓(xùn)練后撤掉平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，12月齡組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(0.1±0.2)明顯低于3月齡組(0.8±0.2，P<0.01)。見圖2。

與3月齡組比較：1) P<0.01,2) P<0.05；(A)游泳軌跡圖；(B)潛伏期圖2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.3 蛋白表達(dá)變化 12月齡組小鼠海馬和聽皮層p-TrkB蛋白表達(dá)均低于3月齡組，提示與3月齡小鼠比較，12月齡小鼠TrkB蛋白磷酸化水平降低。兩組小鼠海馬和聽皮層BDNF表達(dá)均無明顯差異。見圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)老年性聾模型小鼠C57BL/6J在12月齡中年期即發(fā)生了明顯的認(rèn)知功能下降，這可能與其早發(fā)的聽力損失有關(guān)。有報(bào)道，無早發(fā)型老年性聾的CBA/CaJ小鼠，在18個(gè)月仍能保持較好的學(xué)習(xí)和記憶功能，從另一個(gè)方面證明了認(rèn)知功能的下降與聽力損失可能存在某種聯(lián)系〔7〕。而對(duì)于聽功能是如何影響認(rèn)知功能的，目前尚不十分清楚。有研究表明，對(duì)于聽功能喪失的補(bǔ)償可能引起與癡呆相關(guān)的神經(jīng)血管和神經(jīng)生理學(xué)改變，進(jìn)而引起認(rèn)知功能的下降〔8〕。還有學(xué)者認(rèn)為，老年性聾可以引起皮層改變，進(jìn)而影響與老年癡呆相關(guān)的腦區(qū)發(fā)生病理改變〔6,9〕。

聽皮層是聽覺通路的高級(jí)中樞，聽皮層的功能異常和病理改變是老年性聾的重要發(fā)病機(jī)制之一〔10,11〕。海馬是反映認(rèn)知功能的主要腦區(qū)，與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。神經(jīng)解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，聽覺信息到達(dá)海馬的通路主要有兩條：丘腦投射系統(tǒng)從耳蝸神經(jīng)核團(tuán)經(jīng)過內(nèi)膝體到上橄欖核、中腦隔核、聽皮層，這條通路經(jīng)皮層聯(lián)合區(qū)域進(jìn)入內(nèi)嗅區(qū)，到達(dá)海馬；由耳蝸神經(jīng)核經(jīng)非丘腦通路、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、隔核進(jìn)入海馬〔12〕。還有研究表明，海馬CA1區(qū)與聽皮層存在直接的神經(jīng)聯(lián)系〔13〕。因此，海馬和聽皮層是研究老年性聾與認(rèn)知功能障礙關(guān)系必不可少的部位。BDNF即腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育中起重要作用，與學(xué)習(xí)記憶功能及AD等疾病密切相關(guān)，通常與TrkB蛋白相結(jié)合產(chǎn)生作用〔14～16〕。TrkB是一種在腦組織中表達(dá)很高的蛋白激酶，是BDNF的受體，對(duì)于神經(jīng)發(fā)展的突觸功能有重要作用〔17〕。研究表明，AD腦組織中TrkB表達(dá)顯著下降〔18〕。BDNF/TrkB通路在認(rèn)知功能及AD的作用已經(jīng)得到證實(shí)〔19〕，但在聽覺系統(tǒng)中的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示TrkB蛋白磷酸化抑制可能參與C57BL/6J小鼠聽功能和認(rèn)知功能下降。BDNF 自身表達(dá)無明顯變化，可能機(jī)制是BDNF通過結(jié)合TrkB，使TrkB磷酸化，其磷酸化位點(diǎn)募集下游效應(yīng)因子，從而激活下游信號(hào)通路〔20〕。

1 Hol MK,Snik AF,Mylanus EA,etal.Long-term results of bone-anchored hearing aid recipients who had previously used air-conduction hearing aids〔J〕.Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2005;131(4):321-5.

2 Castiglione A,Benatti A,Velardita C,etal.Aging,cognitive decline and hearing loss:effects of auditory rehabilitation and training with hearing aids and cochlear implants on cognitive function and depression among older adults〔J〕.Audiol Neurootol,2016;21(1):21-8.

3 Gates GA,Beiser A,Rees TS,etal.Central auditory dysfunction may precede the onset of clinical dementia in people with probable Alzheimer′s disease〔J〕.J Am Geriatr Soc,2002;50(3):482-8.

4 Yu YF,Zhai F,Dai CF,etal.The relationship between age-related hearing loss and synaptic changes in the hippocampus of C57BL/6J mice〔J〕.Exp Gerontol,2011;46(9):716-72.

5 Wayne RV,Johnsrude IS.A review of causal mechanisms underlying the link between age-related hearing loss and cognitive decline〔J〕.Ageing Res Rev,2015;23(Pt B):154-66.

6 Fortunato S,Forli F,Guglielmi V,etal.A review of new insights on the association between hearing loss and cognitive decline in ageing〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Ital,2016;36(3):155-66.

7 Bielefeld EC,Tanaka C,Chen GD,etal.Age-related hearing loss:is it a preventable condition〔J〕.Hear Res,2010;264(1-2):98-107.

8 Wong PC,Jin JX,Gunasekera GM,etal.Aging and cortical mechanisms of speech perception in noise〔J〕.Neuropsychologia,2009;47(3):693-703.

9 Meredith MA,Keniston LP,Allman BL.Multisensory dysfunction accompanies crossmodal plasticity following adult hearing impairment〔J〕.Neuroscience,2012;214(1):136-48.

10 Gr?schel M,Hubert N,Müller S,etal.Age-dependent changes of calcium related activity in the central auditory pathway〔J〕.Exp Gerontol,2014;58(1):235-43.

11 Zhong Y,Hu Y,Peng W,etal.Age-related decline of the cytochrome c oxidase subunit expression in the auditory cortex of the mimetic aging rat model associated with the common deletion〔J〕.Hear Res,2012;294(1-2):40-8.

12 Moxon KA，Gerhardt GA，Bickford PC，etal.Multiple single units and population responses during inhibitory gating of hippocampal auditory response in freely moving rats〔J〕.Brain Res,1999;825(1-2):75-85.

13 Cenquizca LA,Swanson LW.Spatial organization of direct hippocampal field CA1 axonal projections to the rest of the cerebral cortex〔J〕.Brain Res Rev,2007;56(1):1-26.

14 Poo MM.Neurotrophins as synaptic modulators〔J〕.Nat Rev Neurosci,2001;2(1):24-32.

15 Bekinschtein P,Cammarota M,Katche C,etal.BDNF is essential to promote persistence of long-term memory storage〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2008;105(7):2711-6.

16 Fumagalli F,Racagni G,Riva MA.The expanding role of BDNF:a therapeutic target for Alzheimer′s disease〔J〕.Pharmacogenomics J,2006;6(1):8-15.

17 Reichardt LF.Neurotrophin-regulated signalling pathways〔J〕.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2006;361(1473):1545-64.

18 Ginsberg SD,Che S,Wuu J,etal.Down regulation of trk but not p75NTR gene expression in single cholinergic basal forebrain neurons mark the progression of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem,2014;97(2):475-87.

19 Zhang F,Kang Z,Li W,etal.Roles of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase B(BDNF/TrkB) signalling in Alzheimer′s disease〔J〕.J Clin Neurosci,2012;19(7):946-9.

20 Lai KO,Wong AS,Cheung MC,etal.TrkB phosphorylation by Cdk5 is required for activity-dependent structural plasticity and spatial memory〔J〕.Nat Neurosci,2012;15(11):1506-15.

〔2017-01-13修回〕

(編輯 李相軍)

Mechanisms of cognitive function decline of the presbycusis mice model

FANG Yi-De, HE Zu-Yan, CHEN Dan,etal.

Experimental Teaching Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Objective To observe the cognitive function decline and the mechanisms of presbycusis mice model.Methods The male C57BL/6J mice aged 3 months (young) and 12 months (middle-aged) were used. Auditory brainstem response (ABR) was used to test the hearing function. Morris water maze was used to examine the spatial learning and memory. Western blot was used to examine the BDNF and p-TrkB protein expression.Results ABR showed that the hearing threshold levels of 12 months old mice at 8,16,24 and 32 kHz were higher than those of 3 months old mice (P<0.01). The hidden platform test showed that the latency of 12 months old group was higher than that of 3 months old group from the third training day to the fifth training day (P<0.01, P<0.05). In probe test, the numbers of platform location crossing in 12 months old group increased significantly compared to that of 3 months old group (P<0.05). Western blot showed that the expression levels of p-TrkB in 12 months old group decreased significantly compared to 3 months old group. The expression of BDNF had no difference between two groups.Conclusions The significant cognitive decline is found in C57BL/6J mice, which might be related to the early onset of presbycusis. The phosphorylation of TrkB in hippocampus and auditory cortex might be one of the mechanisms.

Presbycusis; Cognitive decline; Hippocampus; Auditory cortex

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102695)；上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目(14YZ064)

董 楊(1980-)，女，副教授，主要從事中醫(yī)藥防治老年病的研究。

方儀德(1996-)，男，中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)本科生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合學(xué)研究。

R764.4；R592

A

1005-9202(2017)13-3124-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.002