李艷青，朱秀高，史 紅

（1.濰坊科技學(xué)院生物研發(fā)中心，山東 壽光 262700；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100000；3.武漢回盛生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430042）

新生仔豬玉米赤霉烯酮中毒的處理

李艷青1，朱秀高2,3，史 紅3

（1.濰坊科技學(xué)院生物研發(fā)中心，山東 壽光 262700；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100000；3.武漢回盛生物科技股份有限公司，湖北 武漢 430042）

對(duì)臨床發(fā)現(xiàn)的由母豬采食玉米赤霉烯酮含量超標(biāo)飼料引起仔豬中毒的病例進(jìn)行了檢測(cè)分析，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果出具了針對(duì)性處理建議，為臨床此類案例的處理提供借鑒。

新生仔豬；玉米赤霉烯酮；陰戶紅腫

玉米赤霉烯酮（ZEA）是由鐮刀菌分泌產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)雌激素樣作用的真菌毒素，該毒素在玉米和小麥等原糧中廣泛存在，其毒性作用的主要靶器官是生殖系統(tǒng)[1]。2016年10月山東某豬場(chǎng)產(chǎn)房仔豬集中性出現(xiàn)出生后陰戶紅腫、八字腿和產(chǎn)房腹瀉等癥狀，給豬場(chǎng)造成了很大損失，通過對(duì)發(fā)病前后的調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確定是由ZEA中毒導(dǎo)致。

1 發(fā)病情況

該豬場(chǎng)存欄母豬700頭多頭，母豬用自配料、仔豬用全價(jià)料，2016年9月中旬外購一批玉米，購入5 d后開始使用，使用約8 d后產(chǎn)房仔豬開始腹瀉，發(fā)病日齡集中在產(chǎn)后7 d左右，糞便呈灰色、黏稠樣，發(fā)病率約60%，病死率很低；腹瀉出現(xiàn)4 d后，產(chǎn)房新生仔豬中的小母豬普遍出現(xiàn)程度不等的陰戶紅腫（圖1），發(fā)病率約占90%，沒有死亡；還有約20%新生仔豬出現(xiàn)八字腿樣神經(jīng)癥狀（圖2），死亡率超過80%。庫存玉米有明顯的霉變粒、碎粒，約占20%。

2 診斷

圖1 初生仔豬的陰戶紅腫

根據(jù)臨床癥狀與病史調(diào)查，初步懷疑發(fā)病是由ZEA中毒造成，為了確診，取發(fā)病豬3頭、玉米、母豬自配料和肥豬全價(jià)料送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)和霉菌毒素檢測(cè)。

2.1 材料與方法

2.1.1 材料

病料組織：分別采取3頭病豬的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟和腦。

飼料：玉米（1號(hào)）、母豬自配料（2號(hào)）和肥豬全價(jià)料（3號(hào)）各500 g。

檢測(cè)試劑：PCR及RT-PCR試劑均購自Takara 公司，黃曲霉毒素B1（AFB1） E L ISA檢測(cè)試劑盒和ZEA ELISA檢測(cè)試劑盒均購自南京柏發(fā)生物公司。

儀器：DYF-400A搖擺式高速粉碎機(jī)、SCQ-5201B超聲波提取儀、Thermo MuLtiskan FC型 酶 標(biāo) 儀、Eppendorf PCR儀、GE凝膠成像系統(tǒng)。

2.1.2 方法

圖2 初生仔豬的八字腿

PRRSV和PCV的檢測(cè)：分別將3頭豬的各組織病料剪取1 g 左右，加生理鹽水3 mL 研磨，4 ℃下 5 000 r/ min 離心10 min；取上清 300 μL加入 600 μL TRIZOL，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，靜置5 min，加氯仿200 μL，蓋緊管蓋劇振15 s，靜置 2 min，4 ℃下 12 000 r/min離心10 min；取上清400 μL，加入800 μL冰凍的異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃靜置 15 min，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min；棄上清，用1 mL75%DEPC（焦碳酸二乙酯）處理的冰乙醇洗滌、瞬離，吸盡管底液體，晾干；加入20 μL DEPC水溶解管底及管壁RNA。從3頭豬各混合組織病料中所得RNA提取物按張燕霞[2]和蔣成硯[3]等人的方法分別檢測(cè)PRRSV和PCV。

PRV的檢測(cè)：分別將3頭豬的各組織病料剪取1 g左右，加生理鹽 水5 mL 研 磨，4 ℃ 下12 000 r/ min 離心2 min；取上清液250 μL加入750μL DNAZOL混勻后室溫放置3 min，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min；取800 μL上 清， 加 入500 μL的70%DNAZOL+30%乙 醇溶液，混勻后室溫放置5 min，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL75%的乙醇，輕輕振蕩后4 ℃下12 000 r/min離心2 min，棄上清，晾干；加入40μL 8 mM的NaOH 溶解。從3頭豬各混合組織病料中所得DNA提取物按李艷[4]等人的方法檢測(cè)PRV。

AFB1的檢測(cè)：分別取9種樣品各500 g粉碎后、過20目篩，秤取每種各5 g樣品分別放于9個(gè)100 mL具塞三角瓶，向其中加入25 mL甲醇水溶液（1：1），振蕩15min、過濾，棄去1/4初濾液后收集濾液作為樣品提取液，用樣品稀釋液將樣品提取液稀釋后制成待測(cè)液，取待測(cè)液50 μL加入微孔中進(jìn)行ELISA測(cè)定，在450 nm處測(cè)定各孔的吸光度，按說明書中的方法計(jì)算各樣品中AFB1的含量。

ZEA的檢測(cè)：從上述粉碎樣品中秤取每種各5 g樣品分別放于9個(gè)150 mL具塞三角瓶，向其中加入25 mL甲醇水溶液（6：4），用超聲波提取10 min，靜置5 min，用定量濾紙快速過濾、收集濾液。取5 mL濾液用樣品稀釋液做10倍稀釋制成待測(cè)液，取待測(cè)液50 μL加入微孔中進(jìn)行ELISA測(cè)定，在450 nm處測(cè)定各孔的吸光度，按說明書中的方法計(jì)算各樣品中ZEA的含量。

2.2 結(jié)果

病原檢測(cè)，用PCR未檢測(cè)到任何病原，PRRSV、PCV和PRV均呈陰性。霉菌毒素檢測(cè)，3種飼料中AFB1的含量均低于國家標(biāo)準(zhǔn)，玉米和自配料中玉米ZEA的含量極顯著高于國家標(biāo)準(zhǔn)、全價(jià)料中ZEA的含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。

3 處理與分析

根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合豬場(chǎng)發(fā)病情況，確認(rèn)本次發(fā)病是由于母豬采食了用ZEA含量明顯超標(biāo)玉米配制的飼料，且時(shí)間較長造成，即病因是ZEA中毒。建議豬場(chǎng)采取如下措施：1）立即停止使用此次采購剩余的玉米及自配料，換用品質(zhì)好的玉米并對(duì)玉米進(jìn)行過篩處理，或換用母豬全價(jià)料；2）飼料中加入含酵母細(xì)胞壁和改性蒙脫石的脫霉劑2 kg/t，使用一個(gè)月；3）飲水中加入葡萄糖10 kg/t，供母豬和產(chǎn)房仔豬飲用，使用15 d；4）有神經(jīng)癥狀的仔豬按淘汰處理。

霉菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中分泌產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。自然界中霉菌分布極其廣泛，土壤、空氣、水體等幾乎任何地方在條件合適的情況下都會(huì)有霉菌生長，養(yǎng)殖業(yè)中使用的飼料及其原料如玉米、麩皮等非常容易受到霉菌污染。這些原料及制成的飼料被霉菌污染后，如果沒有及時(shí)采取有效處理措施，動(dòng)物采食后就會(huì)對(duì)其造成影響。

霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的危害從毒素方面考慮，呈現(xiàn)明顯的“種屬性”、“量效性”和“累積性”，三者之間相互關(guān)聯(lián)。除一些普遍性癥狀，如免疫抑制、繁殖性能下降和增重緩慢外，不同種屬霉菌分泌的毒素所造成的臨床危害也有差異，目前臨床常見的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬毒素（FB）、嘔吐毒素（DON）和ZEA，危害的靶器官分別主要為肝臟、腎臟、肺臟、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，臨床多表現(xiàn)肝臟腫大、石灰尿、肺水腫、嘔吐等。本病例中初生仔豬的陰戶紅腫是由ZEA中毒引起，該毒素具有類雌激素的作用，被豬攝入后會(huì)引起以生殖系統(tǒng)為主的一系列病變，母豬表現(xiàn)為外觀可見的陰戶紅腫、乳房腫脹等類似母豬發(fā)情時(shí)的癥狀[5，6]，公豬會(huì)由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的機(jī)能和結(jié)構(gòu)受到損傷而主要表現(xiàn)為睪丸萎縮、精子質(zhì)量下降和性欲降低等[7]。懷孕母豬飼料中ZEA含量超標(biāo)后嚴(yán)重的可引起流產(chǎn)、死胎，常見的多為初生仔豬陰戶紅腫，如果哺乳母豬日糧中存在ZEA的過量則會(huì)通過乳汁繼續(xù)傳給仔豬引起癥狀的加劇。

動(dòng)物中毒的嚴(yán)重程度與飼料中含有的霉菌毒素量和與霉菌毒素的接觸時(shí)間長短直接相關(guān)。通常急性中毒多導(dǎo)致動(dòng)物的直接死亡，AFB1在143．1 μg/ kg時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致犬的發(fā)病死亡；慢性中毒的臨床表現(xiàn)會(huì)隨霉變飼料攝入時(shí)間的長短而有所不同，攝入時(shí)間越長，毒素在體內(nèi)的積累就越多，對(duì)動(dòng)物造成的損害也就越嚴(yán)重。臨床上常見的霉菌毒素中毒多是慢性中毒，這是由于目前養(yǎng)殖戶對(duì)霉菌毒素造成的危害有了普遍性認(rèn)識(shí)，對(duì)飼料原料會(huì)進(jìn)行篩選和前期處理，使得飼料中霉菌毒素含量顯著下降。本案例中，豬場(chǎng)在接收玉米時(shí)也進(jìn)行了前期處理，但由于機(jī)器故障故只處理了一小部分，加之長時(shí)間儲(chǔ)存造成了霉菌毒素含量的增加，母豬在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)這些飼料的攝入引起體內(nèi)ZEA的積聚，并通過奶水或胎盤傳給了吃奶的仔豬及胎兒，造成仔豬ZEA中毒。

表1 3種飼料的霉菌毒素檢測(cè)結(jié)果 μg/kg

發(fā)生霉菌毒素中毒后的首要措施是停止霉菌毒素超標(biāo)飼料的攝入，并在飼料中加入具有抑制霉菌生長和吸附霉菌毒素功能霉菌毒素綜合控制性添加劑，其次要采取解毒措施，并注意保護(hù)肝臟功能，使中毒癥狀盡快消除。目前研究在日糧中同時(shí)添加酵母細(xì)胞壁和改性蒙脫石可明顯提高對(duì)玉米赤霉烯酮及黃曲霉毒素的吸附效果，因此吸附性脫霉劑最好選擇同時(shí)含有兩種成分的產(chǎn)品。針對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)的中毒癥狀，要通過加快肝臟代謝，增強(qiáng)肝臟功能來消除中毒癥狀。

[1] 王青，周丹朝，趙煜，等．玉米赤霉烯酮的生殖毒性研究進(jìn)展[J]．畜牧獸醫(yī)雜志， 2014，33(4)：32-35．

[2] 張燕霞， 吳發(fā)興， 鄭輝， 等． 北美型豬藍(lán)耳病病毒鑒別RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用 [J]．中國動(dòng)物檢疫，2011，28(12)： 36-38．

[3] 蔣成硯，謝昆，田婷．豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用 [J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2012，(23)： 83-85．

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[5] 楊在賓，姜淑貞，楊維仁．玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶仔豬毒性機(jī)理研究進(jìn)展[C]．動(dòng)物營養(yǎng)研究進(jìn)展，2012，345-359．

[6] 王青，周丹朝，趙煜，等．玉米赤霉烯酮的生殖毒性研究進(jìn)展[J]．畜牧獸醫(yī)雜志，2014， 33(4)：32-35．

[7] 鄭王龍，劉青，王亞軍，等．玉米赤霉烯酮對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體的損傷作用[J]． 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34(7)：1157-1161．

2017-03-31）