李豫皖 金瑛 熊華章 劉毅

貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨一科（貴州省遵義市563000）

膝關(guān)節(jié)韌帶組織工程的研究進展

李豫皖 金瑛 熊華章 劉毅

貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨一科（貴州省遵義市563000）

目的：對目前膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶在體內(nèi)外的研究進展，應(yīng)用及價值進行綜述。方法：查閱國內(nèi)外近年來關(guān)于組織工程韌帶構(gòu)建治療膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的相關(guān)應(yīng)用文獻，對包括種子細胞、生長因子和支架材料三大要素對構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶的研究進展進行總結(jié)。結(jié)果：種子細胞、支架材料的篩選和適當?shù)纳L因子是構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的核心和必要條件。種子細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化和生長因子的濃度選擇及配比是構(gòu)建良好組織工程韌帶的關(guān)鍵，而實現(xiàn)膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶在體內(nèi)存活和更好發(fā)揮生物學效用，仍需進一步研究。隨著生物醫(yī)學及材料科學的發(fā)展，膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的構(gòu)建方法及方式在不斷改進。

膝關(guān)節(jié)；組織工程韌帶；種子細胞；生長因子；支架材料

人前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）作為限制膝關(guān)節(jié)前傾，防止脛骨向前過度移位，維持膝關(guān)節(jié)正?；顒优c穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，其組織學結(jié)構(gòu)為結(jié)締組織。在膝關(guān)節(jié)損傷中，前交叉韌帶較為常見，其多為撕裂或斷裂傷，且運動性損傷在年輕患者中的發(fā)病率更高，例如落地、變向、扭轉(zhuǎn)等動作中[1]。由于支配ACL的血管較少，血供較差，因此ACL損傷后一般難以自行修復[2]。據(jù)統(tǒng)計，美國每年有30萬名新增膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷患者，絕大部分患者需要手術(shù)重建治療[3]。目前膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷患者大量采用關(guān)節(jié)鏡下ACL重建術(shù)，移植物種類較多，包括自體腘繩肌腱、以LARS韌帶為代表的人工韌帶和同種異體移植韌帶等，但重建術(shù)后存在諸多并發(fā)癥，如關(guān)節(jié)僵硬、肌力下降、移植物免疫排斥反應(yīng)、重建后移植物斷裂，遠期并發(fā)癥如膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率比正常人群高[4]。除了膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷后韌帶重建手術(shù)方式方法的改進、術(shù)后康復及膝關(guān)節(jié)生物力學機制的探討以外，對組織工程化膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶的研究也是目前研究熱點，因為這對于改善韌帶重建手術(shù)移植物的選擇具有重要意義。膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶以生物材料與再生醫(yī)學為基礎(chǔ)，目的在于通過種子細胞經(jīng)生長因子作用后與支架搭載，使得新生韌帶組織達到一定的機械強度并具有相應(yīng)的生物活性及組織相容性，促進ACL的修復與再生，為膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷提供了新型的治療模式[5，6]。通過查閱近年來相關(guān)組織工程化韌帶修復和重建ACL的文獻，對種子細胞、生長因子和支架材料的研究進展綜述如下。

1 種子細胞

由于韌帶組織特殊的解剖學結(jié)構(gòu)及其復雜的生物學功能，因此對于構(gòu)建組織工程化韌帶，種子細胞的篩選至關(guān)重要[7]。ACL主要由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及纖維連接蛋白為主（約90%以上），其余為細胞和細胞外基質(zhì)蛋白構(gòu)成，細胞外基質(zhì)蛋白主要以彈性蛋白為主[8]。組織工程種子細胞的篩選是構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶非常重要的環(huán)節(jié)，組織工程化韌帶種子細胞主要是成體來源的成纖維細胞，包括韌帶細胞、肌腱細胞、肌細胞，其中韌帶細胞來源于ACL、髕韌帶、內(nèi)外側(cè)副韌帶等；肌腱細胞來源于跟腱、髕腱等；不同組織來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）也是構(gòu)建組織工程化韌帶的重要種子細胞來源[9，10]。

人前交叉韌帶成纖維細胞（human anterior cruci?ate ligament fibroblast cells，hACLFs）來源于人前交叉韌帶，與其他組織來源的成體細胞相比，hACLFs在膠原蛋白合成和免疫排斥方面具有明顯優(yōu)勢[11]，Brune等采用形態(tài)完整與斷裂的ACL組織中提取的韌帶成纖維細胞植入支架材料并進行體外培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)兩組的韌帶成纖維細胞在形態(tài)學、肌動蛋白及韌帶基本結(jié)構(gòu)方面無顯著性差異，這說明可以使用自身損傷或斷裂后的ACL作為種子細胞來源，經(jīng)體外分離培養(yǎng)后反過來治療ACL損傷[12]。Nguyen等[13]使用hACLFs來治療山羊橫斷性ACL和內(nèi)側(cè)副韌帶損傷，并發(fā)現(xiàn)hACLFs作用于韌帶斷面的膠原纖維的含量顯著性上升，組織學特征顯示韌帶的愈合具有相似的內(nèi)在愈合反應(yīng)，斷裂載荷顯著提高。但hACLFs由于其體外分離培養(yǎng)較困難，培養(yǎng)周期較長，增殖能力較其他細胞弱[14]，因此hACLFs并不能完全充當組織工程韌帶最優(yōu)的種子細胞。

MSC作為近年來組織工程化韌帶新興的種子細胞，相比成體細胞具有諸多優(yōu)勢，MSC具有較強的增殖活性，具有免疫調(diào)節(jié)、定向歸巢功能，具有高豐度、高純度等特點[15]，并且MSCs具有向成骨、成軟骨、成脂及多向分化的潛能[16]，目前已廣泛用于骨損傷、骨髓損傷、肝臟、血管損傷等疾病的動物模型體內(nèi)研究[17-19]。以骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）為代表的MSC已廣泛應(yīng)用于組織工程韌帶相關(guān)體內(nèi)外研究。劉毅等研究發(fā)現(xiàn)鼠BMSCs可在體外大量增殖，與韌帶細胞共培養(yǎng)，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子與堿性成纖維細胞生長因子作用后，可向韌帶細胞誘導分化，且誘導后細胞增殖能力及活性增加，韌帶相關(guān)特異性基因表達上調(diào)[20]。也有研究證明，BMSCs可在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨、半月板及韌帶損傷或退變處定向歸巢、增殖并向損傷細胞誘導分化，且促進血管生成，降低韌帶損傷細胞的凋亡，對損傷組織進行修復再生[21]。Fu等的研究發(fā)現(xiàn)，前交叉韌帶殘端組織中存在有MSCs，這些MSCs具有自我更新及多向分化潛能，在韌帶損傷后，這些保留在殘端的MSCs可被歸巢并遷徙至損傷處進行自我修復及再生，其中一部分細胞還可以向韌帶細胞分化，這說明韌帶受損后并非不能自我修復及愈合，并且這種來源于前交叉韌帶殘端組織特異的MSC很有可能作為韌帶或肌腱再生過程中理想的種子細胞來源[22]。

由于上述hACLFs本質(zhì)為成纖維狀細胞，屬成熟的體細胞，基本無再分化能力，且hACLFs在體外擴增速度較慢，需要在韌帶組織培養(yǎng)過程中敏感時期制備細胞，因此對韌帶損傷的修復能力有限[23]。然而，MSCs在體外擴增及分化能力較強，隨傳代次數(shù)的增加，可短時間內(nèi)獲得大量細胞，因此使用生長因子及給予不同的體外培養(yǎng)條件，可以讓MSCs定向向韌帶細胞誘導分化，為韌帶的修復再生提供了新思路。

對種子細胞進行不同培養(yǎng)條件及方式培養(yǎng)以滿足組織工程構(gòu)建的需求，是組織工程亟需解決的難題。研究顯示對MSC與目的細胞共培養(yǎng)，可以獲得活性更高、數(shù)量更多的種子細胞，使種子細胞在數(shù)量及功能上與目的細胞更相近。Wu等[24]研究通過大鼠BMSCs與肌腱細胞共培養(yǎng)，可顯著增加肌腱相關(guān)特異性基因的表達和膠原基質(zhì)的產(chǎn)生，尤其在共培養(yǎng)細胞比例為1︰1或5︰1時，其共培養(yǎng)的細胞形成的細胞膜片可促進大鼠髕腱愈合。Canseco等[25]通過對豬ACLFs與MSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對豬ACL重建有更好的效果，當細胞比例為1︰1時，其Ⅰ、Ⅲ型膠原，細胞連接素（Tenas?cin-C）表達有顯著性提高。此外，以1︰1比例共培養(yǎng)4周時，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例與正常的韌帶組織最為相近，因此相對其他細胞培養(yǎng)模式，1︰1比例的共培養(yǎng)模式可促進MSC向hACLFs細胞分化，甚至加快韌帶損傷的愈合。Yu等[26]研究顯示，通過使用缺氧誘導因子1-α（HIF-1α），采用人受損肌腱細胞與脂肪源性間充質(zhì)干細胞（ADMSCs）間接共培養(yǎng)，可以提高ADMSCs向肌腱細胞分化，另外在低氧環(huán)境下對兩種細胞共培養(yǎng)（O2＜2%）可增強分化效果，上調(diào)HIF-1α基因的表達，這提示缺氧培養(yǎng)條件下經(jīng)HIF-1α激活并表達對于ADMSCs向肌腱細胞分化具有重要作用，這為ADMSCs在肌腱再生的體內(nèi)應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。Veronesi等[27]通過構(gòu)建ADMSCs與大鼠肌腱細胞體外間接共培養(yǎng)模型，研究探討了衰老和雌激素缺乏對肌腱細胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)老年人的雌激素缺乏可提高肌腱細胞的增殖和治愈率，但相比于正常組的ADMSCs與肌腱細胞共培養(yǎng)誘導效果，老年人雌激素缺乏的ADMSCs其增殖和肌腱相關(guān)基因包括COL-Ⅰ、Ⅲ，Scx和Decorin，Tenas?cin-C蛋白表達相對較低，作者發(fā)現(xiàn)，異體ADSCs在提高肌腱細胞增殖、膠原表達及愈合率方面要高于自體細胞。

利用膝關(guān)節(jié)韌帶細胞與MSCs通過共培養(yǎng)及其他培養(yǎng)條件，可使MSCs處于目的細胞的生長外環(huán)境下，并接受目的細胞分泌的細胞因子及建立相關(guān)細胞連接，使MSCs更好地誘導生成韌帶細胞。此外，將制好的種子細胞搭載在支架上移入受體體內(nèi)，種子細胞在體內(nèi)可以釋放多種趨化及細胞因子，增強種子細胞在體內(nèi)的增殖，促進支架與受體相容，促進損傷愈合，并使體內(nèi)韌帶、滑膜細胞向損傷及支架處遷移、增殖，達到體內(nèi)韌帶再生的目的。Parolini等[28]發(fā)現(xiàn)MSCs在其分子表型鑒定中低表達組織相容性Ⅰ類抗原，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，同時也低表達共刺激分子CD14、CD80、CD83、CD86、CD40L等及組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，這說明MSCs具有較低的免疫原性，不引起或較低度引起同種異體或異種的淋巴細胞增殖反應(yīng)，即不會或較低度引起免疫排斥及炎癥反應(yīng)，從而保護支架等移植物，強化韌帶的修復。

2 生長因子

生長因子在組織修復過程中，常?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞增殖及細胞轉(zhuǎn)化來提高細胞活性及增強細胞效應(yīng)；并且生長因子在細胞連接信號的跨膜傳導，啟動細胞內(nèi)基因的上調(diào)或下調(diào)以影響新蛋白的產(chǎn)生，調(diào)整細胞增殖、分化、趨化及胞外基質(zhì)和血管的生成過程方面起著舉足輕重的作用，如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等[29-32]。

bFGF屬于與肝素有很強親和力的生長因子家族，分布于垂體、腦和神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜、腎上腺等組織，其中垂體中含量最高，其生物學作用極其廣泛，具有促進細胞增殖、向成纖維狀分化，促進血管生成及肉芽組織再生作用，且在神經(jīng)組織生長發(fā)育過程中也十分重要，因此對于韌帶及肌腱損傷的修復可能具有至關(guān)重要的作用[33]。Leong等人[34]的研究評估了組織工程重建鼠前交叉韌帶中肝素介導的bFGF的釋放，結(jié)果顯示釋放bFGF的支架有更明顯的韌帶機械應(yīng)力提高和細胞增殖，相比于無bFGF釋放組有顯著性差異，這說明應(yīng)用組織工程的方法對前交叉韌帶斷裂具有治療潛力。Chenghao等[35]單獨和聯(lián)合使用bFGF和神經(jīng)酰胺激活的蛋白磷酸酶（CaPP）對纖維蛋白凝塊促進腱骨愈合的影響進行研究，結(jié)果顯示，經(jīng)bFGF和CaPP處理后的纖維蛋白凝塊，植入到兔跟腱后，細胞增殖加快，腱骨連接更加成熟，相比于未用生長因子處理組，組織學評分更高，骨橋蛋白、堿性磷酸酶、RUNT及相關(guān)膠原的mRNA表達水平均有顯著提高，bFGF和CaPP加載于纖維蛋白凝塊可進一步增強早期愈合。Tang等[36]研究顯示，腺病毒超量轉(zhuǎn)染bFGF和VEGF基因后，可有效糾正肌腱損傷后愈合不完全，相比于對照組，可顯著提高I型膠原的細胞外分子的生成，加速細胞增殖，提高拉伸力。這些結(jié)果表明，生長因子為解決肌腱和韌帶內(nèi)源性及外源性愈合能力不足提供了一種有效的治療可能。

TGF-β系調(diào)節(jié)細胞生長及分化的TGF-β超家族。這一家族除TGF-β外，還有活化素、抑制素和骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）。TGF-β這種細胞因子可以使正常的成纖維細胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化[37]，TGF-β有三個亞型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β 3。相關(guān)研究提示，TGF-β可促進成纖維細胞、成骨細胞的增殖生長[38]；TGF-β1和TGF-β2可通過調(diào)節(jié)IL-6基因轉(zhuǎn)錄并促進人成纖維細胞IL-6的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，抑制免疫活性細胞的增殖，抑制淋巴細胞的分化等[39]；TGF-β1還可促進細胞外基質(zhì)（ECM）的生成，如膠原蛋白、纖維連接蛋白的表達，抑制ECM降解[40]。金瑛等[41]通過對人羊膜間充質(zhì)干細胞（hAMSCs）向膝關(guān)節(jié)韌帶細胞分化，使用TGFβ1和bFGF進行細胞定向誘導，在經(jīng)過體外誘導后，Ⅰ、Ⅲ型膠原，纖維連接蛋白和細胞連接素等韌帶相關(guān)特異性基因表達上調(diào)，韌帶特異性蛋白合成增加。Xie等[42]使用等雙軸拉伸模仿機械損傷ACL和內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）成纖維細胞后，使用TGF-β1誘導ACL和MCL編碼賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），結(jié)果顯示LOX可以促進膠原生成及彈性蛋白交聯(lián)，增加ECM的生成，且MCL中的LOX表達比ACL更高。

BMP作為TGF-β家族的一大成員，其成骨效應(yīng)已被大量研究證實。Takigami等[43]采用BMP-2聯(lián)合自體半肌腱對兔ACL損傷行韌帶重建術(shù)，術(shù)后采用組織學和生物力學分析，結(jié)果顯示在實驗組第8和12周時，隧道內(nèi)的新骨已取代移植的肌腱，并且出現(xiàn)了腱骨交接面處的典型組織學特征。生物力學測試顯示12周時，實驗組拉伸強度較對照組更大，這說明BMP-2具有成骨效應(yīng)，可促進腱骨愈合。Ruschke等[44]對不同年齡段的患者進行分級，使用BMP-2在不同時間點刺激體外培養(yǎng)的存在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者ACL和健康組ACL成纖維細胞，并對Smad和相關(guān)基因及關(guān)鍵信號磷酸化蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)BMP-2基因介導的Smad1/5/8的磷酸化水平在不同年齡段的患者中存在差異，BMP-2/Smad靶基因如ID1和Smad6與正常組相比要低，這說明BMP-2在延緩ACL退變過程中發(fā)揮重要效用。Cheng等[45]研究發(fā)現(xiàn)BMP-2與VEGF聯(lián)合使用可以促進韌帶與纖維軟骨附著點處的腱骨愈合。Kuroda等[46]在大鼠骨缺損模型中使用BMP-12基因轉(zhuǎn)染重建肌腱及韌帶樣組織，結(jié)果顯示，通過2周的BMP-12轉(zhuǎn)基因誘導，轉(zhuǎn)染后的組織纖維化明顯，骨形成于第8周，重建8、12周后腱骨愈合良好，說明BMP-12基因轉(zhuǎn)染對肌腱韌帶樣組織再生愈合有促進作用。

此外，諸多生長因子如PDGF、VEGF、富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）[47]、表皮生長因子（epider?mal Growth Factor，EGF）[48]、生長分化因子（growth-dif?ferentiation factor，GDF）[49]、胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors，IGF）[50]均可促進膝關(guān)節(jié)韌帶組織的修復再生。Komzak研究[47]顯示PRP中含有大量的血漿內(nèi)血小板，其濃度達到106/μL以上，PRP中含有高于正常血漿中5倍左右的生長因子，具有促進細胞及組織愈合的能力。但也有研究提示單獨使用PRP對韌帶組織的修復能力較弱，因此仍不能作為膝關(guān)節(jié)韌帶損傷最佳的治療方式，關(guān)于PRP最佳劑量、與其他生長因子聯(lián)合應(yīng)用的作用時間及使用方法等需要更進一步探討。Woo等[48]研究發(fā)現(xiàn)光固定化EGF誘導人ACL細胞，可促進其快速增殖。Tashiro T等[49]觀察使用GDF-5對大鼠MCL間隙損傷的修復作用，結(jié)果顯示，3周時，韌帶強度較對照組明顯提高，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達上調(diào)，組織中的膠原纖維直徑增加，說明應(yīng)用GDF-5可促進韌帶愈合。Herchenhan等[50]研究IGF-1對工程化人肌腱組織中的Ⅰ型膠原合成的影響，發(fā)現(xiàn)IGF可補充促進膠原蛋白的形成，對早期肌腱拉傷的荷載具有正性調(diào)節(jié)作用。

目前用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶的生長因子種類較多，但作用效果并非一成不變，具有聯(lián)合性、時效性。通過完善生長因子的控制及釋放技術(shù)，可達到對韌帶損傷更優(yōu)更自然的修復再生。然而生長因子與種子細胞作用過程中產(chǎn)生的生物相容效應(yīng)，其內(nèi)部的分子信號機制很多尚未明了，仍需要進一步研究和探討。目前在構(gòu)建韌帶組織工程研究中應(yīng)用較多的生長因子見表1。

表1 生長因子在構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶中的應(yīng)用研究

3 支架材料

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶所選擇的支架材料應(yīng)擁有機械強度高，與種子細胞的搭載、黏附、增殖、發(fā)揮生物活性等功能，且要與移植物受體存在較好的組織相容性，并能夠在生物體內(nèi)降解以促進韌帶細胞組織完全生長，更快地促進膝關(guān)節(jié)韌帶組織再生和修復。用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的支架材料包括生物材料型支架、可降解合成材料支架、天然材料支架。

3.1 生物材料型支架

生物材料型支架主要由ECM構(gòu)成，其主要骨架由蛋白質(zhì)構(gòu)成，主要來源于人、牛、馬等哺乳動物而制成的脫細胞支架（decellularized matrix as scaffold）[51，52]，如肌腱片、心包或真皮組織、小腸粘膜等，這類支架經(jīng)過去除其他膠原成分，主要保留以Ⅰ型膠原為主（占90%以上）的膠原蛋白[53]。Cheng等[54]的體外實驗顯示，早期脫細胞真皮支架能夠較好地搭載兔ACL細胞并可以保持較快的增殖速度和細胞活性，但隨著時間的延長，植入動物體內(nèi)的支架其附著細胞逐漸減少，支架的機械拉伸能力降低，這說明脫細胞支架其功能并不能完全滿足構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的需要，甚至出現(xiàn)免疫排斥的風險[55]。此后，Grier等[56]研發(fā)出一種膠原-粘多糖復合支架（GAG），并探討了馬肌腱細胞特異性基因的表達和生物活性與改變支架孔徑和交聯(lián)密度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)支架具有較高的交聯(lián)密度和較小的孔徑能夠更好地促進細胞代謝活性，保持并增加肌腱及韌帶相關(guān)基因的表達。這些結(jié)果表明，通過改變支架材料的交聯(lián)密度和孔隙大小可提高人工肌腱的結(jié)構(gòu)功能和機械拉力。為了提高上述支架的機械性能和生物相容性，研究人員采用特殊的處理方式，如潘娟等[57]制備犬來源的脫細胞肌腱片，用于促進兔肩袖損傷的腱骨愈合，研究發(fā)現(xiàn)12周時，損傷的腱骨界面肉芽組織消失，成纖維細胞，Sharpey纖維、新生軟骨和軟骨細胞數(shù)量增多，腱骨界面成熟，說明經(jīng)反復凍融結(jié)合核酸酶處理后制備的犬脫細胞肌腱片可促進兔肩袖損傷腱骨愈合。

天然蠶絲支架作為一種傳統(tǒng)的生物材料，其生物相容性良好，在拉伸強度方面與人ACL組織相似，其生物降解速度較慢，可以在生物體內(nèi)保持基本的拉伸強度不變的條件下達數(shù)十月[58]，說明蠶絲支架可較長時間保護膝關(guān)節(jié)內(nèi)部韌帶的穩(wěn)定性，為新生韌帶細胞和組織提供足夠的修復再生時間，讓膠原蛋白、纖維連接及血管的生成與自體原有韌帶相似。Teuschl等[59]使用蠶絲纖維支架對羊ACL重建的組織學研究發(fā)現(xiàn)，新型蠶絲纖維支架能刺激體內(nèi)條件下ACL再生，重建后細胞增殖提高再生組織的活性，蠶絲纖維含量在6個月時開始明顯下降，12個月后基本消失，提示使用蠶絲纖維支架重建ACL可以為膝關(guān)節(jié)損傷提供新治療選擇。Chen等[60]研究通過Scleraxis基因在人胚胎干細胞來源（hESCs）的MSCs中過度表達與針織蠶絲膠原支架聯(lián)合構(gòu)建組織工程化肌腱，發(fā)現(xiàn)Scleraxis基因和機械應(yīng)力的刺激可提高MSCs中肌腱相關(guān)特異性基因表達，并且在動物體內(nèi)肌腱修復模型中機械刺激可促進細胞的重新排列，MSCs在針織蠶絲支架上大量增殖并分化，膠原纖維直徑增大，組織學評分和拉伸能力更高。此外，也有文獻報道殼聚糖[61]、巖藻酸[62]和透明質(zhì)酸（HA）[63]等生物材料型支架用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶。

3.2 可降解合成材料支架

人工合成的可降解材料支架在延展拉伸性能、降解速度、搭載細胞及與支架受體生物相容性方面均有很大的提高。膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶研究和應(yīng)用較多的可降解合成材料為聚乳酸（PLA）[64]及其共聚物（PLGA）[65]、聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）[66]、左旋聚乳酸（poly l-lactic acid，PLLA）[67]等。Toosi等[68]使用膠原-PGA海綿支架搭載BMSCs，結(jié)果顯示BMSCs在膠原-PGA海綿支架的細胞活力、增殖和分化均有顯著提高。掃描電鏡顯示PGA支架具有連通孔隙，大小為190μm，膠原-PGA海綿支架在BMSCs的細胞黏附、增殖率和成骨分化方面要優(yōu)于單一的膠原支架，說明PGA支架是在不損害生物相容性的情況下可有效加強膠原海綿支架的效用。Deepthi等[69]使用分層殼聚糖膠原水凝膠與PLLA支架構(gòu)建納米纖維屈肌腱組織再生，發(fā)現(xiàn)膠原水凝膠經(jīng)電紡后分層與海藻酸巖凝膠外涂可以防止肌腱的粘連，PLLA支架聯(lián)合分層殼聚糖膠原水凝膠具有良好的細胞增殖特性，可促進屈肌腱再生，肌腱細胞在支架中附著良好。Pinese等[70]使用PLA-聚環(huán)氧乙烯針織支架加強ACL愈合，結(jié)果顯示ACL在PLA-聚環(huán)氧乙烯針織支架中增殖效果良好，具有良好的細胞相容性，通過線形、扭曲、繩狀、編織狀這4種空間排布，三維編織的針織PLA-聚環(huán)氧乙烯支架符合韌帶組織的力學性能，可作為韌帶重建的支架材料。Khan等[71]采用PLGA-己內(nèi)酯/L-丙交酯（PLCL）聯(lián)合支架，通過靜態(tài)和循環(huán)模式體外培養(yǎng)，觀察其對韌帶組織工程韌帶拉伸、扭轉(zhuǎn)相關(guān)力學性能的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLGA-PLCL在靜態(tài)條件下定植具有良好的細胞相容性。生物力學測試顯示兩種支架的降解程度存在競爭關(guān)系且降解過程中與水解酶和PLGA的水解作用相關(guān)，研究說明PLGA支架的結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)環(huán)境有很大關(guān)系，包括生物相容性和細胞來源等，但PLGA在組織工程韌帶中的良好應(yīng)用必須通過延緩其降解及改進結(jié)構(gòu)來完成。此外還有研究報道多種支架聯(lián)合[72]，生長因子[73]、生物活性因子[74]與支架聯(lián)合使用等加強膝關(guān)節(jié)韌帶組織的修復與再生?？傊琍LA強度較高，PGA降解速度較快，PLGA的降解性和拉伸性能與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系、調(diào)節(jié)范圍更大。就理想的支架選擇而言，控制其降解速率，增強其機械性能，細胞相容性良好，對于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶均有重要意義。

目前支架材料均處于基礎(chǔ)研究階段，其臨床適用性還有待進一步評估[75]。見表2。

表2 構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的常見支架材料

4 培養(yǎng)體系與反應(yīng)條件

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶需要的反應(yīng)條件，包括對種子細胞和目的細胞的培養(yǎng)方法，如單層共培養(yǎng)、Transwell共培養(yǎng)、三維培養(yǎng)等[76]，使目的細胞所分泌的細胞因子影響并促進種子細胞向目標細胞分化；對支架提供一定的力學刺激，如壓縮力、剪切力、流體壓力[77]，創(chuàng)造出與機體相似的內(nèi)環(huán)境，促進營養(yǎng)物質(zhì)與種子細胞充分均勻接觸，增進細胞的增殖分化和ECM相關(guān)蛋白的合成，在液體流動培養(yǎng)基的影響下讓種子細胞與支架材料分布更加勻稱。另一方面，相關(guān)力學刺激可影響正常體內(nèi)的韌帶生長，體外移植韌帶也等同于自然韌帶，需要機械信號的一系列刺激。近年研究[78，79]提示通過機械力刺激韌帶細胞可改變細胞的黏附活性和細胞骨架的重塑，并且可促進韌帶細胞生成更多的Ⅰ、Ⅲ膠原，然而要尋找到膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶最適的機械力學刺激，還需對膝關(guān)節(jié)韌帶形成中的力學傳導通路機制進行研究。

5 展望

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶，需要對種子細胞的篩選、支架材料的分類、生長因子的合理搭配及培養(yǎng)體系與反應(yīng)條件等多個環(huán)節(jié)的搭配與重塑。隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，我們可以選擇與機體具有更好生物相容性、機械拉伸性能更佳的組織工程人工韌帶，在此過程中需要更深入研究膝關(guān)節(jié)韌帶損傷后的修復與再生機制。而要獲得組織工程化韌帶與人膝關(guān)節(jié)韌帶功能上的完全一致，尚需生命科學、工程力學、材料科學等多專業(yè)學科在不同領(lǐng)域的不斷發(fā)展和合作。

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2016.10.17

貴州省科技廳社會發(fā)展科技攻關(guān)項目（黔社科合SY字[2010]3091）；貴州省科學技術(shù)基金資助項目（黔科合LH字[2016] 7477號）

劉毅，Email：13308529536@163.com