陳藝杰解幸承吳 雙吳珍紅李顯春,5繆曉青,3

（1福建農(nóng)林大學蜂學學院；2福建農(nóng)林大學蜂療研究所；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實驗室，福州350002；4中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193；5 Department of Entomology and BIO5 Institute,The University of Arizona,Tucson,AZ 85721,USA）

中華蜜蜂Takeout（AcTO1）基因的克隆和表達分析

陳藝杰1,2,4解幸承4吳 雙1,2,4吳珍紅1,2李顯春4,5繆曉青1,2,3

（1福建農(nóng)林大學蜂學學院；2福建農(nóng)林大學蜂療研究所；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實驗室，福州350002；4中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193；5 Department of Entomology and BIO5 Institute,The University of Arizona,Tucson,AZ 85721,USA）

Takeout（TO）是一種昆蟲節(jié)律性調(diào)控輸出基因，廣泛分布于涉及到化學感受和營養(yǎng)功能的相關組織。TO基因主要參與昆蟲的生長發(fā)育、行為調(diào)節(jié)及多種生理代謝過程。為探究TO基因是否參與社會性昆蟲的勞動分工，我們克隆并分析了中華蜜蜂Apis cerana TO基因的編碼框序列，測定了該基因在哺育蜂和采集蜂各個組織部位的mRNA表達水平，旨在為深入研究該基因的功能提供參考。本研究通過RT-PCR的方法首次克隆獲得AcTO1基因的cDNA序列，利用生物信息學軟件分析了該基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并利用熒光定量PCR（qPCR）技術檢測了該基因在中華蜜蜂3種采集蜂（18日齡正常采集蜂、22日齡正常采集蜂和7日齡提前采集蜂）和2種哺育蜂（7日齡正常哺育蜂和22日齡超齡哺育蜂）頭部、胸部和腹部的表達量。本研究克隆獲得的中華蜜蜂TO(命名為AcTO1)基因的cDNA序列長度為1058 bp，開放閱讀框（ORF）長度為738 bp，編碼246個氨基酸，預測蛋白分子量為27.09 kDa，理論等電點為8.40。AcTO1蛋白的信號肽位于1-17位氨基酸，無跨膜結構，屬于分泌型蛋白。AcTO1的氨基酸序列種含有一個JHBP超家族保守結構域。qPCR結果顯示，AcTO1在3種采集蜂和2種哺育蜂的各組織均有表達，其中表達量由高到低依次為頭部、胸部、腹部。AcTO1基因的表達具有組織依賴型，主要表達于頭部，且所有采集蜂的頭部表達量均高于哺育蜂，由此說明該基因可能參與蜜蜂的勞動分工。本研究克隆了中華蜜蜂takeout基因的全長cDNA序列，并分析了該基因的序列特征和表達譜，結果表明該基因可能參與調(diào)控蜜蜂的勞動分工。

蜜蜂；勞動分工；takeout基因；基因克隆

Takeout（TO） 蛋白最初在果蠅 drosophila melanogaster中被鑒定并命名[1]。隨后，許多研究發(fā)現(xiàn)這類基因普遍存在于多種昆蟲中，并在昆蟲的生命活動中發(fā)揮著非常重要的作用。So等[2]研究發(fā)現(xiàn)這類基因可能與果蠅攝食行為的節(jié)律調(diào)控有關。Benito等[3]報道TO基因作為節(jié)律輸出基因，其表達會隨著節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子PAR蛋白1（Pdp 1ε）水平的變化而變化，并發(fā)現(xiàn)低水平的Pdp1ε就可以激活TO基因的表達。另外，TO基因主要在果蠅的消化系統(tǒng)和觸角等攝食有關的組織中表達，而且還可以通過饑餓誘導其表達，從而加強覓食活動[1,4]。Saito等[5]發(fā)現(xiàn)TO基因在桑蠶Bombyx mori中是作為一種轉(zhuǎn)運信號分子參與調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝及行為活動。TO基因有助于岡比亞按蚊Anopheles gambiae對食物質(zhì)量及營養(yǎng)狀況做出不同反應[6]。TO基因可能調(diào)節(jié)埃及伊蚊Aedes aegypti對宿主或者食物的反應[7]。因此，TO基因在昆蟲調(diào)控生物節(jié)律、攝食和營養(yǎng)平衡中起著重要作用。

蜜蜂是一種典型的高度社會化昆蟲，該群體存在著合理的勞動分工[8]。例如，蜂王和雄蜂共同負責繁殖，而工蜂在巢內(nèi)的職責會隨著日齡的改變而變化。一般而言，剛出房后的工蜂主要負責清理巢房、泌蠟造脾、飼喂蜂王和小幼蟲等巢內(nèi)工作。此后，隨著年齡的增長，工蜂主要在巢外承擔采集花蜜、花粉、水、樹膠以及巢門防衛(wèi)等工作[9]。前期未發(fā)表的中華蜜蜂哺育蜂和采集蜂頭部轉(zhuǎn)錄組測序結果表明，工蜂采集蜂TO基因的表達量顯著高于哺育蜂。為探究TO基因在蜜蜂中的表達規(guī)律和相關生物學功能，本研究以中華蜜蜂Apis cerana為試驗材料，基于轉(zhuǎn)錄組測序拼接結果，利用RT-PCR技術首次克隆獲得中華蜜蜂AcTO1基因的cDNA序列，對該基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行了分析，并利用qRT-PCR技術檢測了該基因的時空表達譜，以期能為進一步闡述該基因的分子功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

中華蜜蜂樣本于2014年4～6月份采自福建省福州市北峰神蜂科技中蜂養(yǎng)蜂場。

1.1.1 蜜蜂的標記：選擇群勢較強、健康無病的正常蜂群，從中抽出封蓋子較多的子脾，應保證封蓋子將會在2日內(nèi)全部羽化出房，置于人工培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)（34℃）。次日，選取羽化出房后的蜜蜂約4000只，采用無味無毒的油漆在背部標記后放回蜂群。

1.1.2 蜂群的組織：本試驗需要組織2種蜂群，分別為正常蜂群和同齡群，每種蜂群均需3次生物學重復。正常蜂群：選擇適宜群勢大小的蜂群，蜂群中包含正常發(fā)育而來的哺育蜂、采集蜂和正在產(chǎn)卵的蜂王。同齡群：根據(jù)Whitfield等[10]的方法，將標記后的蜜蜂（至少3000只）放入準備好的觀察箱，箱內(nèi)有一只正在產(chǎn)卵的蜂王（提前育王）和一個含有蜂蜜和花粉的巢脾。在實驗前階段，做好蜂箱的保暖措施。

1.1.3 樣品的收集：為排除年齡和發(fā)育相關因素的影響，鑒于蜜蜂的勞動分工隨日齡變化而變化的特性，采樣方法如下：在正常蜂群中，選取7日齡正常哺育蜂（YN:Age-matched/young nurses）、18日齡和 22日齡的正常采集蜂（OF:Age-matched/old foragers）。在同齡群中，選取7日齡提前發(fā)育的采集蜂（YF:Young/precocious foragers）和 22 日齡超齡哺育蜂（ON:Old/over-aged nurses）作為樣品采集標準。哺育蜂是經(jīng)油漆標記的正在飼喂蜂王或小幼蟲的蜜蜂。采集蜂是經(jīng)油漆標記的攜帶花粉歸來的蜜蜂。各類型蜜蜂每日齡均取樣30只左右，立即置于液氮中進行瞬時冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

分別取上述3種采集蜂（18日齡正常采集蜂、22日齡正常采集蜂和7日齡提前采集蜂）和2種哺育蜂（7日齡正常哺育蜂和22日齡超齡哺育蜂）相應的頭部、胸部和腹部3個組織，按照Wang等[11]人的方法提取總RNA，并合成cDNA第一鏈。

1.3 引物設計

以本課題組前期所獲得的中華蜜蜂頭部轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫為基礎，通過Blastn序列比對得到目的基因片段。使用Primer Premier 5.0軟件在保守區(qū)設計引物擴增AcTO1基因的cDNA序列。根據(jù)克隆得到的序列預測該基因的開放閱讀框（ORF），并在編碼區(qū)用Beacon Designer軟件設計特異性引物用于熒光定量PCR，其中內(nèi)參基因選取β-actin和Rps18基因。所需的引物序列信息詳見表1，均由北京華大基因科技有限公司合成。

1.4 AcTO1基因的cDNA克隆

以反轉(zhuǎn)錄后的中華蜜蜂cDNA樣品為模板，利用表1中的克隆引物擴增AcTO1基因。PCR反應體系（20 μl） 如下：Ex Taq 0.1 μl，10×buffer 2 μl，dNTP 1.6 μl，正反向引物各 1 μl，cDNA 模板 1 μl，RNase-Free Water 13.3 μl。反應程序設置如下：95℃預變性 3 min；95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共計 30個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取目的片段進行回收純化，并將回收產(chǎn)物連接至pGM-T載體，隨后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)藍白斑篩選鑒定，選取陽性克隆擴大培養(yǎng)，將菌液送至北京華大基因科技有限公司測序。

表1 本試驗所用引物

1.5 AcTO1基因的序列分析

利 用 NCBI Blastn（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具進行核酸序列的同源性分析；利用在線軟件 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找序列的開放閱讀框（ORF）；氨基酸序列通過Lasergene EditSeq工具預測。保守區(qū)分析利用在線軟件 NCBI Conserved Domains Search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。 利 用 Prot－Param（http://web.expasy.org/protparam/）預測蛋白的分子量和等電點等理化性質(zhì)；利用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽序列；利用TMHMM-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜結構；利用ProtScale（http://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl利用）進行疏水性分析；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析功能結構域；利用 PSORT II（http://psort.hgc.jp/form2.html）和LocTree 3（https://rostlab.org/services/loctree3/）進行亞細胞定位。

1.6 熒光定量PCR反應

以各樣品的cDNA為模板，使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑進行熒光定量PCR。反應體系為20 μl：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl，50×RO×Reference Dye△ 0.4 μl，正反向引物各 0.5 μl，cDNA 模板 2 μl，RNase Free Water 6.5 μl。反應條件：95℃預變性 15 min；95℃ 10 sec，60℃ 20 sec，72℃ 32 sec，共 40 個循環(huán)；最后為熔解曲線分析。每個樣品均取3次生物學重復。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

熒光定量結果用ABI 7500 Software v2.0.5軟件進行分析處理。根據(jù)標準曲線及熒光曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析[12]。采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，選用Duncan's法做顯著性分析，顯著水平為P=0.05。所得結果均以平均數(shù)±標準誤（Mean±SE）表示，并利用GraphPad Prism 5軟件繪圖。

2 結果

2.1 AcTO1基因的cDNA克隆與序列分析

以中華蜜蜂cDNA樣品為模板進行PCR擴增，得到的目的產(chǎn)物片段大小為1058 bp（圖1），這與預期結果一致，并將該基因提交至GenBank，登錄號為KY792889。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳分析

采用ORF Finder對所獲得的序列分析表明，中華蜜蜂AcTO1基因的完整開放閱讀框（ORF）為738 bp，共編碼246個氨基酸。AcTO1蛋白分子式為C1219H1986N328O350S8，預測分子量為27.09 kDa，理論等電點為8.40，且該蛋白為堿性蛋白。在組成AcTO1蛋白的18種氨基酸中，亮氨酸（Lys）所占的比例最高，達到13.9%；帶正電荷氨基酸總數(shù)（Arg+Lys）為24，帶負電荷氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）為26；總平均疏水系數(shù)（GRAVY）為 0.167，不穩(wěn)定系數(shù)為36.79，脂溶系數(shù)為1115.67，說明該蛋白比較穩(wěn)定。

利用SignalP 4.1對中華蜜蜂AcTO1蛋白的信號肽進行預測，結果顯示信號肽均于1-17位氨基酸，剪切位點位于17位和18位氨基酸之間，無跨膜結構。在線NCBI結構域分析結果表明，AcTO1編碼產(chǎn)物的第7-244位氨基酸之間存在一個JHBP superfamily的保守結構區(qū)域。疏水性分析顯示，AcTO1的氨基酸序列中，第32位氨基酸Score值最低為-2.178，第8位氨基酸最高為3.133，平均疏水性為0.167。亞細胞定位結果表明，AcTO1蛋白可能存在于細胞外（22.2%）、液泡（11.1%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（33.3%）、線粒體（22.2%）和細胞核（11.1%）中，主要集中在分泌途徑上，說明該蛋白屬于分泌型蛋白。

2.2 中華蜜蜂AcTO1基因的mRNA時空表達譜分析

通過實時熒光定量PCR技術分析TO基因在中華蜜蜂2種哺育蜂（正常哺育蜂和超齡哺育蜂）和3種采集蜂（2種不同日齡的正常采集蜂和提前采集蜂）不同組織中mRNA水平的表達差異，結果如圖2所示。TO基因在中華蜜蜂不同哺育蜂和采集蜂的頭部、胸部和腹部中均有表達。但是，所有采集蜂和哺育蜂頭部中的表達量均極顯著高于其它組織（P＜0.01）。因此我們將5種工蜂的頭部組織的表達量進一步分析，結果發(fā)現(xiàn)3種正常采集蜂的頭部表達量均高于2種哺育蜂，其中18和22日齡的采集蜂的頭部表達量均顯著高于7日齡正常哺育蜂和22日齡超齡哺育蜂。

3 討論

Takeout蛋白家族在昆蟲中被廣泛研究，Sarov-Blat等[1]通過cDNA差減雜交技術首次鑒定得到了DmTO基因，并證明了該基因是果蠅生物節(jié)律和取食與饑餓之間的直接分子聯(lián)系。隨后，發(fā)現(xiàn)了這種蛋白普遍存在于昆蟲中，并具有多種重要的功能。目前，關于TO基因的研究主要集中在果蠅、家蠶、白蟻等模式昆蟲，而在蜜蜂中很少有相關報道[2,3,5]。為探究TO基因是否參與社會性昆蟲的勞動分工，本文克隆并分析了中華蜜蜂Apis cerana TO基因的編碼框序列，測定了該基因在哺育蜂和采集蜂各組織部位的mRNA表達水平，旨在為深入研究該基因的功能提供參考。

圖2 takeout基因在中華蜜蜂不同發(fā)育階段、不同組織中的表達量

分泌蛋白是指在細胞質(zhì)核糖體上合成，并分泌到細胞外發(fā)揮作用的一類蛋白質(zhì)。幾乎所有的分泌蛋白都具有信號肽，為N端的15～35個氨基酸的疏水性序列，在蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜分泌過程中具有重要作用[13]。信號肽是檢測蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白的一個重要指標[14]。張松斗等[15]發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲TO蛋白序列含有23個氨基酸的信號肽。通過序列分析發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂TO蛋白的N末端具有17個氨基酸的信號肽序列。這些結果表明不同物種的TO蛋白均屬于分泌蛋白。亞細胞定位軟件PSORT II和LocTree 3預測結果也顯示AcTO1蛋白主要集中在分泌途徑上，與上述推斷一致。此外，AcTO1蛋白的理論等電點pI為8.40，為堿性蛋白。AcTO1蛋白預測的期望跨膜螺旋數(shù)為0，所編碼的蛋白為非跨膜蛋白，這與張松斗之前的報道一致[15]。氨基酸序列分析還發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂AcTO1蛋白的氨基酸序列在N端位置有2個非常保守的Cys殘基，說明該蛋白具有配體結合特性[16]。

基因的表達部位在一定程度上反應了該基因的功能。TO基因在昆蟲內(nèi)的表達具有組織特異性，比如許多研究通過原位雜交技術對其進行檢測，TO基因主要表達于果蠅的前胃和嗉囊、岡比亞按蚊的觸角、黑花蠅的觸角和下唇須、家蠶的中腸和煙草天蛾的頭部等組織[1,5,6,17,18]。這些結果表明TO基因表達具有組織特異性，同時也暗示著該基因功能的多樣性。昆蟲的頭部是取食和感覺的中心，擁有口器和觸角等相關器官；胸部是昆蟲主要的活動中心，擁有大量的肌肉，足和翅著生在此。因此可以預測TO基因的表達量頭部和胸部要高于腹部。經(jīng)熒光定量PCR檢測，中華蜜蜂的TO基因在頭部表達量最高，腹部最低，這與預期一致。有意思的是，本文中TO基因在蜜蜂中的表達屬于組織依賴型，主要表達于頭部組織。So等[2]人表明TO基因參與調(diào)控生物節(jié)律和營養(yǎng)平衡。在蜂群中，哺育蜂在巢內(nèi)較為黑暗的環(huán)境下進行與日節(jié)律無關的工作，而采集蜂在巢外進行與日夜節(jié)律密切相關的采集活動，這也表明蜜蜂的采集行為與日節(jié)律變化相關，因此我們推測TO基因可能參與調(diào)控蜜蜂的生物節(jié)律[19,20]。此外，Meunier等人[4]發(fā)現(xiàn)TO基因在果蠅調(diào)控攝食中起著重要作用。蜜蜂的采集行為也就是取食行為，所以進一步推測TO基因參與調(diào)控蜜蜂的采集行為。先前研究報道Per、For和Mvl等基因在采集蜂頭部的表達量高于哺育蜂，表明這些基因可能與蜜蜂的采集行為有關[21-23]。本文中，TO基因在不同發(fā)育階段的表達屬于行為依賴型，暗示著該基因在蜜蜂不同發(fā)育階段對不同行為的反應是不一樣的。TO基因在所有的采集蜂頭部的表達量都要高于哺育蜂。這些結果充分說明TO基因很可能參與調(diào)控蜜蜂的采集行為。

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Cloning and expressional analysis of a takeout gene in Apis cerana

Chen Yijie1,2,4,Xie Xingcheng4,Wu Shuang1,2,4,Wu Zhenhong1,2,Li Xianchun4,5,Miao Xiaoqing1,2,3
(1 College of Bee Science Fujian Agriculture and Forestry University;2 Apitherapy Institute of Fujian Agriculture and Forestry University;3 State and Local Joint Engineering Laboratory of Natural Biotoxin,Fuzhou 350002,China;4 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China;5 Department of Entomology and BIO5 Institute,The University of Arizona,Tucson,AZ 85721,USA)

The takeout(TO)gene is a circadian clock-regulated output gene abundantly expressed in several tissues that are related to perception of chemical signals and nutrition acquisition in insects.TO protein is known to be involved in growth and development,behavior regulation and metabolism of the solitary insects.But it remains unclear whether TO protein is also involved in the division of labor in social insects.In order to address this general question and reveal its additional functions,we cloned the Apis cerana TO (AcTO1)gene and analyzed its expression levels in different tissues and developmental stages between nurse bees and forager bees.We obtained the cDNA sequence of AcTO1 by RT-PCR and analyzed its nucleotide and amino acid sequences using bioinformatics software.We also measured its expression levels in the head,thorax and abdomen of three types of forager bees (18-day old normal foragers,22-day old normal foragers,7-day old Young/precocious foragers)and two types of nurse bees (7-day old normal young nurses and 22-day old over-aged nurses)by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).The AcTO1 cDNAsequence obtained by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)was 1058 bp in length.It has an open reading frame (ORF)of 738 bp,encoding a protein of 246 amino acids.The predicted molecular weight of AcTO1 was 27.09 kDa and its theoretical isoelectric point was 8.40.AcTO1 protein contains a N-terminal signal peptide of 17 amino acids but lacks transmembrane domains,suggesting that AcTO1 was a secreted protein.AcTO1 protein also has an highly conserved JHBP (juvenile hormone binding protein)domain.In the three kinds of foragers and two kinds of nurses,AcTO1 expressed at the highest level in the head,followed by the thorax,and then the abdomen.Moreover,AcTO1 transcripts in the head were significantly higher in all the three kinds of forager bees than in the two kinds of nurse bees.Such expression profile implies that AcTO1 was probably associated with the division of labor between nurses and foragers.This study determined the sequence characteristics of AcTO1 and its expression profiles.The data suggest that AcTO1 may be involved in the division of labor between nurses and foragers.

honey bee;division of labor;takeout gene;gene cloning

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-45-KXJ19）

陳藝杰（1991-），男，碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品醫(yī)療與保健

繆曉青（1959-），男，教授，研究方向為蜂學，E-mail:mxqsf88@126.com