陳照亮劉紅楊會(huì)利高玉凱張娟吉文玉

·論著·

微小核糖核酸592調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞凋亡

陳照亮*○☆劉紅*楊會(huì)利*高玉凱*張娟*吉文玉△

目的研究微小核糖核酸592（miR-592）對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251凋亡的影響。方法首先通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)分析miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)變化；隨后向U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-592的擬合物，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析miR-592過(guò)表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響；通過(guò)生物信息學(xué)分析，找到miR-592的潛在靶分子，并通過(guò)熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法等進(jìn)行驗(yàn)證；進(jìn)一步，轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞Runx2的下調(diào)siRNA，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并對(duì)U251細(xì)胞的凋亡進(jìn)行分析。結(jié)果定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，miR-592在腫瘤組織中明顯低表達(dá)（t=2.752，P=0.013）；miR-592過(guò)表達(dá)能明顯抑制U251細(xì)胞的生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，培養(yǎng)36 h、48 h后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.127，P=0.031;t=2.284，P=0.026）；流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，miR-592顯著促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡：對(duì)照組晚期凋亡率為7.2％±0.68％，而轉(zhuǎn)染miR-592組晚期凋亡率為17.47％±1.45％，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t= 3.294，P=0.007）；熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-592直接靶向Runx2的3’-UTR來(lái)抑制Runx2蛋白的水平；檢測(cè)下調(diào)Runx2對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Runx2 siRNA的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比對(duì)照組低（t=3.124，P=0.011），流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)周期的檢測(cè)顯示，Runx2下調(diào)表達(dá)上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率。通過(guò)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)miR-592過(guò)表達(dá)明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)，Runx2的下調(diào)表達(dá)也明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)論miR-592通過(guò)直接靶向Runx2來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 miR-592凋亡Runx2

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最為常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。50％～60％的腦部惡性腫瘤都是膠質(zhì)瘤[1]。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤現(xiàn)有的治療策略主要是手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療或其他方式的輔助性治療[2-4]。然而，高轉(zhuǎn)移率和對(duì)放化療的耐受性使得膠質(zhì)瘤的預(yù)后效果都很差[5-7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸592（miR-592）在膠質(zhì)瘤組織中相對(duì)于癌旁組織明顯表達(dá)降低。為了進(jìn)一步探究miR-592在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中作用機(jī)制，我們應(yīng)用miR-592 mimics上調(diào)miR-592在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中U251中表達(dá)水平，研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)尋找miR-592的靶分子。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室自有）以10％的胎牛血清RPMI-1640（美國(guó)Gibco公司）或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25％的胰酶消化，每?jī)商鞊Q液傳代。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（噻唑藍(lán)）以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，向細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-592mimics或者Runx2的siRNA（上海吉?jiǎng)P基因公司），以隨機(jī)序列的mimic作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，Runx2的siRNA序列：5′-GCACGCUAUUAAAUCCAAATT-3′。12 h后進(jìn)行第一次檢測(cè)：每孔加入5g/L的噻唑藍(lán)液（美國(guó)Sigma公司）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)到4 h后，去掉培養(yǎng)基，加入DMSO（美國(guó)Sigma公司）150μL，用酶標(biāo)儀在490 nm檢測(cè)吸光度。分別于轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h和48 h測(cè)定吸光度（A）值。根據(jù)測(cè)得的A值繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）分析miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)變化。所有樣本用液氮在研缽中研磨，用TRzol（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，并通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)RNA濃度，A260/A280為1.8～2.0。將RNA樣本稀釋成2 ng/μL,按照說(shuō)明書(shū)配置成15μL的逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。取其中2μL作為模板配置成20μL體系進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。反應(yīng)條件為95℃10min預(yù)變性，95℃15 s→60℃30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后得到各個(gè)標(biāo)本和內(nèi)參GAPDH的Ct值。計(jì)算公式：ΔCt＝Ct-CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt（T）-ΔCt（N），相對(duì)表達(dá)計(jì)算公式為2－ΔΔCt。定量引物均購(gòu)自QIAGEN公司,序列如下：Runx2上游引物5′-GACCAGTCTTACCCCTCCTACC-3′, Runx2下游引物5′-CTGCCTGGCTCTTCTTACTGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GAGAGACCCCACTTGCTGCCA-3′,GAPDH下游引物5′-CTCACACTGCCCCTCCCTGGT-3′。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。向細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-592mimics或100 nmol/L的Runx2 siRNA，以隨機(jī)的mimic作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，序列如前所述。48 h后，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次。按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行PI/Annexin V染色細(xì)胞，避光染色20min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞凋亡率分別測(cè)定早期凋亡率及晚期凋亡率，早期凋亡細(xì)胞普遍有細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻現(xiàn)象，晚期凋亡細(xì)胞胞膜完整性遭到破壞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)3個(gè)細(xì)胞群，即正常細(xì)胞（雙陰性）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin V陽(yáng)性，PI陽(yáng)性）和晚期細(xì)胞（雙陽(yáng)性）。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)加入200μLRIPA緩沖液冰上20min裂解細(xì)胞。加入50μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10min后進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)膜，10％BSA溶液封閉，加入稀釋好的抗體工作液，4℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次。再加入HRP標(biāo)記的抗人IgG二抗，TBST洗膜3次后，加上化學(xué)發(fā)光底物，于暗室內(nèi)壓片、曝光、顯影和定影。

1.6 熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以每孔2.0×105個(gè)293T細(xì)胞接種于24孔板。培養(yǎng)24 h后，用lipofectamine2000將報(bào)告質(zhì)粒和miR-592過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，并同步共轉(zhuǎn)入pRL-TK作為對(duì)照質(zhì)粒，用量分別為：報(bào)告質(zhì)粒0.4μg；miR-592過(guò)表達(dá)質(zhì)粒0.4μg；pRL-TK質(zhì)粒0.05μg。轉(zhuǎn)染后6 h換完全培養(yǎng)基。48 h后去上清，用PBS洗去未去干凈的上清，隨后用lysis buffer冰上裂解細(xì)胞，收集上清用于熒光素酶活性檢測(cè)（試劑盒購(gòu)自于Promega）。計(jì)算方法為：熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶讀值/海腎熒光讀值。

1.7 裸鼠腫瘤模型建立購(gòu)買(mǎi)8周齡的BALB/c (nu/nu)裸鼠（上海斯萊克），隨機(jī)分成3組，每組5只。分別皮下接種miR-592穩(wěn)定表達(dá)的U251細(xì)胞、Runx2 siRNA穩(wěn)定表達(dá)的U251細(xì)胞（細(xì)胞系均由上海吉?jiǎng)P基因公司制備），以正常U251細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，細(xì)胞接種量均為6.0×106/只。于接種后每隔5 d游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤大小，以1/3×長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)算腫瘤體積，并于接種后第50天處死小鼠，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組變量之間的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 m iR-592促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡PCR結(jié)果顯示，miR-592在U251中的相對(duì)表達(dá)明顯下降（圖1A）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，與對(duì)照組（4.73± 0.67）比較，miR-592相對(duì)表達(dá)量（16.87±2.43）明顯升高（t=2.752，P=0.013）（圖1B）。miR-592明顯抑制U251細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)36 h、48 h后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.127，P=0.031;t= 2.284，P=0.026）（圖1C）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，miR-592組早期凋亡率（12.94％±1.66％）與對(duì)照組（13.71％±0.80％）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.047，P= 0.113）；miR-592組晚期凋亡率（17.47％±1.45％）與對(duì)照組（7.20％±0.68％）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t= 3.294，P=0.007），miR-592能顯著性上調(diào)U251細(xì)胞凋亡率(圖1D)。

2.2 m iR-592抑制帶有Runx2的熒光素酶活性及蛋白水平熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-592顯著抑制帶有Runx2的3’-UTR的熒光素酶的活性（圖2A）。定量PCR檢測(cè)Runx2表達(dá)結(jié)果顯示，與癌旁組織（23.64±4.39）比較Runx2的相對(duì)表達(dá)在腫瘤組織中（16.31±2.27）明顯下調(diào)（t=5.647，P= 0.002）。western blot轉(zhuǎn)染miR-592后U251細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，miR-592抑制Runx2的蛋白水平（圖2B）。

圖1 mi R-592促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。A：mi R-592在腫瘤和癌旁組織中的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染mimi c s后mi R-592的表達(dá)水平；C：M TT檢測(cè)U251細(xì)胞生長(zhǎng)；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)mi R-592過(guò)表達(dá)后U251細(xì)胞周期。**P＜0.05，與對(duì)照組比較；##P＜0.05，與癌旁組織比較;**P＜0.01，與對(duì)照組比較

2.3 下調(diào)Runx2表達(dá)水平抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Runx2的表達(dá)（圖3A）。下調(diào)Runx2對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了Runx2 siRNA的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比對(duì)照組低（表2）。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)周期的檢測(cè)顯示，Runx2下調(diào)表達(dá)上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率，對(duì)照組與siRunx2組晚期凋亡率分別為1.58±0.25、4.57±0.36，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=3.248，P=0.035）（圖3B）。

2.4 m iR-592通過(guò)靶向Runx2調(diào)控U251的腫瘤的生長(zhǎng)建立裸鼠模型，通過(guò)繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)miR-592過(guò)表達(dá)明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)（圖4）。同時(shí)，Runx2的下調(diào)表達(dá)也明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)（圖4）。

圖2 R u n x2是mi R-592在U251細(xì)胞中的直接靶蛋白。A：熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)；B：R u n x2在轉(zhuǎn)染mi R-592和空白對(duì)照組（N C）后U251細(xì)胞中的表達(dá)。**P＜0.01，與對(duì)照組比較；##P＜0.01，與癌旁組織比較

圖3 下調(diào)R u n x2促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。A：w e s t e r n b lo t驗(yàn)證si R N A下調(diào)效率；B：流式細(xì)胞儀分析R u n x2下調(diào)后細(xì)胞凋亡率。**P＜0.01，與0 h比較

3 討論

microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的非編碼RNA。雖然microRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的總體數(shù)量很少，但是它們卻調(diào)節(jié)了大約30％的基因。microRNA通過(guò)靶向目的分子的3’-UTR來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的水平從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)蛋白的水平[8-9]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道指出microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著各種各樣非常重要的作用[10-13]。我們發(fā)現(xiàn)，miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。合成miR-592的mimics并轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞來(lái)過(guò)表達(dá)miR-592，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-592顯著性的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。流式細(xì)胞檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)miR-592上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率。這些結(jié)果表明，miR-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮著腫瘤抑制基因的功能。

Runx2是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員[14]。它可以形成核心結(jié)合因子（CBF）復(fù)合物結(jié)合到DNA序列上，從而達(dá)到對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用[15]。越來(lái)越多的研究表明Runx2在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤中都有表達(dá)。Runx2的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[16]。下調(diào)Runx2的表達(dá)又可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)生發(fā)展[17]。這些結(jié)果表明Runx2發(fā)揮著腫瘤抑制因子的功能。應(yīng)用熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-592能直接和Runx2的UTR結(jié)合。而在腫瘤組織中Runx2的表達(dá)也明顯上調(diào)，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示過(guò)表達(dá)miR-592的U251細(xì)胞的Runx2的表達(dá)明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明，Runx2是miR-592在U251細(xì)胞中的直接靶分子。

圖4 mi R-592靶向R u n x2抑制U251腫瘤的生長(zhǎng)

表2 Runx2下調(diào)后細(xì)胞生長(zhǎng)情況±s)

表2 Runx2下調(diào)后細(xì)胞生長(zhǎng)情況±s)

1）經(jīng)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，P<0.01

組別對(duì)照組siRunx2組n33 0 h 0.27±0.09 0.25±0.11 12 h 0.41±0.11 0.37±0.10 24 h 0.50±0.16 0.48±0.13 36 h 1.61±0.21 0.94±0.221)48 h 2.28±0.23 1.46±0.211)

為了進(jìn)一步研究Runx2是否是miR-592在U251細(xì)胞中的功能性靶分子，我們通過(guò)siRNA特異性的沉默Runx2的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)Runx2顯著性的抑制U251細(xì)胞的生長(zhǎng)，其凋亡水平也明顯上調(diào)。這個(gè)結(jié)果表明，Runx2是miR-592在U251細(xì)胞中的功能性靶蛋白。

綜上所述，我們得出以下結(jié)論：miR-592通過(guò)直接靶向Runx2促進(jìn)凋亡來(lái)抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)。

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m iR-592 induces apoptotic cell death in human U251 cells.

CHEN Zhaoliang，LIU Hong，YANG Huili，GAO Yukai，ZHANG Juan，JIWenyu.Department of Oncology,Binzhou City Center Hospital,Binzhou 251700.Tel: 0543-5322880.

Objective To investigate the role ofmiR-592 in the Glioma.M ethods We first analyzed the expression ofmiR-592 in Glioma tissues from patients by quantitative PCR.We transfected U251 cells with miR-592 mimics and then detected the growth of cells by MTT assay.We performed dual-luciferase reporter assay and western blot assay to examine whether Runx2 was the direct target ofmiR-592 in U251 cells.In order to test whether Runx2 was the functional target ofmiR-592,we determined the cell growth curve by down-regulating the level of Runx2.Moreover,we also detected the apoptosis of U251 after Runx2 knockdown.Results The expression of miR-592 was significantly reduced in glioma tissues(t=2.752，P=0.013).Over-expressionmiR-592 remarkably increased the apoptotic rate of U251 cells compared with the control group(t=2.127，P=0.031;t=2.284，P=0.026).Flow cytometry analysis showed that MiR-592 significantly promoted apoptotic cell death of U251 cells Apoptosis rate was 7.2％±0.68％in miR-592 group and 17.47％±1.45％in control group(t=3.294，P=0.007).The results of double luciferase assay and Western blot assayshowed thatmiR-592 directly targeted the 3'Runx2 of-UTR to inhibit the level of Runx2 protein.The effect of downregulation of Runx2 on the growth of U251 cells was detected,the results showed that growth was significantly slower in the cells transfected with Runx2 siRNA than in those without Runx2 siRNA(t=3.124，P=0.011).Detection of cycle by flow cytometry showed that runx2 down-regulated the apoptosis rate of U251 cells.Tumor growth curve showed that overexpression ofmiR-592 significantly inhibited tumor growth and the down regulation of Runx2 expresssion also significantly inhibited tumor growth.Conclusion miR-592 suppresses the growth and promotes the apoptotic rate of U251 cells by targeting Runx2.

Glioma U251 miR-592 Apoptotic Runx2

R651

A

2016-11-28)

(責(zé)任編輯：甘章平)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.04.009

*濱州市中心醫(yī)院腫瘤科（濱州251700）

△新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒外一科

○☆通信作者（E-mail:jxjai002@163.com）