吳杭航黃天壬鄧偉方向任靜靜甘膺元

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

廣西肝癌高發(fā)區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌HBV X基因的整合及影響因素分析

吳杭航1，2黃天壬2鄧偉1方向1，2任靜靜1，2甘膺元1，2

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的了解廣西肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）X區(qū)基因在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）染色體中的整合及影響因素。方法以30例與HBV相關(guān)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象。提取HCC組織及癌旁組織標(biāo)本DNA作為模板，以HBV X基因上游序列和人類(lèi)基因組Alu重復(fù)序列為引物，應(yīng)用重復(fù)序列-多聚酶鏈反應(yīng)（Alu-PCR）擴(kuò)增整合的HBV X片段及兩側(cè)的人類(lèi)基因組DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算目的片段整合率并分析相關(guān)的影響因素。結(jié)果18例HCC組織檢測(cè)到HBV X基因的整合片段，整合率為60.00%（18/30）；26例癌旁組織檢測(cè)到HBV X基因的整合片段，整合率為86.67%（26/30）。癌旁組織HBV病毒整合率高于HCC組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.445，P=0.020）。不同性別、年齡、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST的HCC癌組織及其癌旁組織H BV X基因整合率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論廣西肝癌高發(fā)區(qū)癌旁組織比HCC組織HBV整合率高，說(shuō)明HBV整合發(fā)生在感染早期。HBV X基因整合與HCC患者性別、年齡、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST無(wú)明顯關(guān)系。

肝腫瘤；乙型肝炎病毒X基因；整合；廣西

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率居全部惡性腫瘤的第2位，占全世界肝癌死亡人數(shù)的51%［1-2］。廣西作為我國(guó)肝癌的高發(fā)區(qū)，肝癌病死率居惡性腫瘤首位，高于全國(guó)平均水平［3］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝癌發(fā)生的主要原因，患者HBsAg總陽(yáng)性率為84.76%［4］。1980年Brechot等［5］首次發(fā)現(xiàn)在HBV感染的肝癌細(xì)胞中有HBV DNA整合到宿主基因。1995年Minami等［6］建立Alu-PCR用于檢測(cè)HBV病毒-細(xì)胞接頭序列。自此國(guó)內(nèi)外開(kāi)始陸續(xù)報(bào)道肝癌組織中HBV整合的狀況及其致癌機(jī)制，但廣西肝癌高發(fā)區(qū)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中HBV X基因的整合，目前未有相應(yīng)研究。本研究采用Alu-PCR方法擴(kuò)增整合HBV X片段及兩側(cè)人類(lèi)基因組DNA片段，了解目的片段整合率并分析相關(guān)影響因素，為廣西HCC高發(fā)區(qū)HBV相關(guān)性HCC的病因研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

30例患者均來(lái)自廣西肝癌高發(fā)區(qū)扶綏縣，在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行肝癌切除術(shù)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。平均年齡45.4歲（33～70歲），其中男性25例，女性5例。收集研究對(duì)象的臨床資料及手術(shù)切除的HCC組織及癌旁組織（距離癌組織大于5 cm以外的肝組織）標(biāo)本，經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于－80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑和儀器

組織DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，UDG酶購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，PCR產(chǎn)物純化和全自動(dòng)測(cè)序由北京六合華大基因科技公司完成。PCR儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 組織DNA提取

采用德國(guó)QIAGEN公司DNA提取試劑盒，方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 Alu-PCR引物

［7］設(shè)計(jì)引物，第一輪PCR擴(kuò)增引物為HBV上游序列pUTP和正/反向的人類(lèi)基因組重復(fù)序列Alu UP5/T3-515。在合成pUTP和UP5/T3-515時(shí)，用dUTP代替dTTP。第二輪PCR擴(kuò)增引物位于pUTP下游的HBV序列MM37和ALU正/反向序列UP6/ MidT3。第三輪“半巢式”P(pán)CR擴(kuò)增引物為HBV序列MM60和UP6/MidT3。見(jiàn)表1。

表1 Alu-HBV-PCR引物序列

1.5 Alu-PCR擴(kuò)增HBV X基因整合片段

第一輪PCR反應(yīng)以組織DNA為模板，總量不超過(guò)1 000 ng，反應(yīng)體系總體積為100μL，其中引物pUTP、UP5/T3-515各2 uL，Taq DNA聚合酶50μL，加去離子水至100μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物16℃水浴1min，每PCR反應(yīng)液加入U(xiǎn)DG酶5U，37℃消化60 min，使含有dUTP的DNA位點(diǎn)斷裂，95℃10min終止反應(yīng)。第二輪PCR反應(yīng)體系總體積100μL，取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物3μL為模板，引物MM37、UP6/MidT3各2μL，Taq DNA聚合酶50μL，去離子水43μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。第三輪PCR反應(yīng)體系與第二輪相同，取第二輪反應(yīng)產(chǎn)物10μL，稀釋500倍作為第三輪PCR模板，引物MM60、UP6/MidT3各2μL，Taq DNA聚合酶50μL，模板46μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃（正向）/56℃（反向）退火30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.6 測(cè)序及目的片段整合分析

取第三輪PCR產(chǎn)物10μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝聚電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的標(biāo)本送北京六合華大公司（廣州）進(jìn)行純化，并經(jīng)ABI3730x1基因分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序。結(jié)果經(jīng)NCBIBLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析HBV X基因整合的基本情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV X基因整合片段的擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

在30例HCC癌組織及其配對(duì)的癌旁組織中，擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶25例，其中正向PCR結(jié)果9例，反向PCR結(jié)果4例，同時(shí)為正向和反向PCR結(jié)果12例，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1；陽(yáng)性條帶純化后測(cè)序成功18例，其中正向PCR結(jié)果3例，反向PCR結(jié)果12例，同時(shí)為正向和反向PCR結(jié)果3例，共21根條帶，測(cè)序峰如圖2所示。在癌旁組織中擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶29例，其中正向PCR結(jié)果1例，反向PCR結(jié)果3例，同時(shí)為正向和反向PCR結(jié)果24例，部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1；陽(yáng)性條帶純化后測(cè)序成功26例，其中正向PCR結(jié)果和反向PCR結(jié)果各7例，同時(shí)為正向和反向PCR結(jié)果12例，共38根條帶。8P和11P反向反應(yīng)各有兩個(gè)測(cè)序結(jié)果，測(cè)序峰如圖3所示。

2.2 HBV X基因整合率

在30例研究對(duì)象中，總整合率為73.33%（44/60），肝癌組織中18例檢測(cè)到HBV X基因整合片段，整合率為60.00%（18/30）；癌旁組織中26例檢測(cè)到HBV X基因整合片段，整合率為86.67%（26/30）。癌旁組織HBV病毒整合率高于HCC組織（χ2=5.445，P=0.020）。

2.3 HBV X基因整合與HBV感染指標(biāo)的關(guān)系

進(jìn)一步分析影響HBV X基因整合的因素，結(jié)果顯示，不同性別、年齡、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST的HCC癌組織及其癌旁組織HBV X基因整合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 HBV X基因擴(kuò)增部分電泳結(jié)果

圖2 樣本6T測(cè)序結(jié)果峰圖

圖3 樣本6P測(cè)序結(jié)果峰圖

表2 HBV X基因整合的影響因素分析［n（%）］

（續(xù)表）

3 討論

HBV整合到宿主基因是HBV感染過(guò)程常見(jiàn)的現(xiàn)象，有研究顯示，85%～90%的HBV相關(guān)HCC組織可檢測(cè)到HBV DNA整合［8］。隨后大量研究發(fā)現(xiàn)，HBV攜帶者、HBV肝炎患者、肝硬化及HCC患者均可檢測(cè)到HBV DNA整合［9］，可見(jiàn)HBV整合是HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

本研究為提高整合率，同時(shí)應(yīng)用正向和反向HBV-Alu-PCR方法，對(duì)廣西肝癌高發(fā)區(qū)HBsAg陽(yáng)性的HCC組織及其配對(duì)癌旁組織中整合的HBV序列進(jìn)行分析，探討整合HBVDNA與HBV致癌的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌旁組織HBV整合率（86.67%）高于HCC組織（60.00%）。而賀良等［10］采用Alu-PCR技術(shù)檢測(cè)HCC標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)40例HCC中HBV X基因整合率為45.00%。張婷等［11］采用Alu-PCR和LM-PCR方法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)肝癌組織HBV X基因整合率（65.0%）稍低于癌旁組織（67.5%），本研究與張婷等［11］研究結(jié)果一致，且癌旁組織的整合率遠(yuǎn)高于癌組織，說(shuō)明HBV DNA的整合是慢性乙型肝炎發(fā)展成肝癌過(guò)程中的一個(gè)早期事件。此外，本研究的總體整合率高于國(guó)內(nèi)其他研究［12-14］，說(shuō)明廣西肝癌高發(fā)區(qū)HBV X基因整合與HCC的發(fā)生有密切關(guān)系，可能是本地區(qū)HCC發(fā)生率高于全國(guó)水平的原因之一。本研究中12例HCC組織和4例癌旁組織未檢測(cè)出HBV X基因整合序列，可能本身未整合或者HBx的整合序列出現(xiàn)在引物HBx下游或引物Alu上游，也可能整合基因在HBV的S區(qū)或C區(qū)［10］。

進(jìn)一步分析HBV X基因整合條帶與HCC的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性條帶測(cè)序的長(zhǎng)度在335～1008 bp之間，其中2例癌旁組織檢測(cè)到2個(gè)條帶，說(shuō)明HBV基因截短插入宿主基因，片段長(zhǎng)度不一，整合可發(fā)生在不同的位置［15］，與屠紅等［16］的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步證實(shí)截短的HBV X基因產(chǎn)物可影響HCC的發(fā)生發(fā)展，而不需要HBV全長(zhǎng)整合入宿主基因發(fā)揮致癌作用。

關(guān)于HBV X基因整合與HBV感染指標(biāo)及肝功能的關(guān)系，本研究結(jié)果顯示HBV X基因的整合率在不同性別、年齡、HBeAg、HBVDNA、ALT、AST的HCC患者中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。賀良等［10］發(fā)現(xiàn)HBV整合與HCC患者性別、年齡、AFP、癌栓及復(fù)發(fā)等無(wú)關(guān)，與HBV DNA、腫瘤大小、分化程度呈正相關(guān)。Sung等［17］發(fā)現(xiàn)，HBV整合的HCC患者年齡低于未整合者，并認(rèn)為HBV DNA與致癌基因整合，是HCC患者未經(jīng)肝硬化過(guò)程而直接發(fā)生癌變的原因之一。本研究并未得到類(lèi)似結(jié)論，可能與研究例數(shù)較少有關(guān)，也可能說(shuō)明廣西肝癌高發(fā)區(qū)的HBV X基因整合與性別、年齡及HBV感染指標(biāo)的關(guān)系并不密切。當(dāng)?shù)厝巳褐械腍BV基因型及亞型、不同患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種的特征及優(yōu)勢(shì)株以及HBV的某些突變點(diǎn)可能是影響其整合率的關(guān)鍵因素，需在今后的研究中加以驗(yàn)證。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示HBV DNA的整合與HCC有關(guān)，闡明與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的整合位點(diǎn)，對(duì)未來(lái)指導(dǎo)基因診斷和治療具有重要意義［18］。本研究對(duì)廣西肝癌高發(fā)區(qū)的HCC組織和癌旁組織HBV X基因整合率及臨床資料進(jìn)行分析，證實(shí)了HBV DNA的整合是HCC發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)早期事件，為本地區(qū)研究整合HBV DNA與HBV致癌機(jī)制提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Zhao LH，Liu X，Yan HX，et al.Genomic and oncogenic preference of HBV integration in hepatocellular carcinoma［J］.Nat Commun，2016，7：12992.

［2］Wang FS，F(xiàn)an JG，Zhang Z，etal.The globalburden of liver disease：the major impact of China［J］.Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.

［3］余家華，李秋林，容敏華，等.2013年廣西腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.中國(guó)癌癥防治雜志，2017，9（1）：30-39.

［4］魯笑欣，張春燕，黃天壬，等.2004～2013年廣西6201例原發(fā)性肝癌患者乙肝和丙肝病毒感染情況分析［J］.山東醫(yī)藥，2015，55（14）：35-37.

［5］Brechot C，Pourcel C，Louise A，et al.Presence of integrated hepatitis B virus DNA sequences in cellular DNA of human hepatocellular carcinoma［J］.Nature，1980，286（5772）：533-535.

［6］Minami M，Poussin K，Bréchot C，et al.A novel PCR technique Using Alu-specific primers to identify unknown flanking sequences from the human genome［J］.Genomics，1995，29（2）：403-408.

［7］Murakami Y，Saigo K，Takashima H，et a1．Large scaled analysis of hepatitis B virus（HBV）DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas［J］.Gut，2005，54：1162-1168．

［8］Ringelhan M，Heikenwalder M，Protzer U.Direct effects of hepatitis B virus-encoded proteins and chronic infection in liver cancer development［J］.Dig Dis，2013，31（1）：138-151.

［9］Hoang H，Akihiro T，Norifumi K.Role of hepatitis B virus DNA integration in human hepatocarcinogenesis［J］．World JGastroenterol，2014，20（20）：6236-6243．

［10］賀良，耿小平，趙紅川，等.肝細(xì)胞肝癌中乙肝病毒基因整合位點(diǎn)及臨床病理分析［J］.肝膽外科雜志，2013，21（2）：129-132.

［11］張婷，許強(qiáng)，楊紫偉，等.原發(fā)性肝細(xì)胞癌中乙型肝炎病毒基因整合的突變分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（3）：313-317.

［12］趙翎皓，周偉平.乙肝病毒（HBV）對(duì)于肝癌宿主基因組的插入整合及其機(jī)制研究［D］.第二軍醫(yī)大學(xué)，2016.

［13］Yan H，Yang Y，Zhang L，et al.Characterization of the genotype and integration patterns of hepatitis B virus in early-and late-onset hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2015，61（6）：1821-1831.

［14］王效軍，李濤，李彩紅.原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者肝細(xì)胞HBV DNA整合位點(diǎn)的初步探討［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（1）：105-107.

［15］Pollicino T，Saitta C，Raimondo G.Hepatocellular carcinoma：the pointofview ofthehepatitisBvirus［J］.Carcinogenesis，2011，32（8）：1122-1132.

［16］屠紅，高海峰，馬國(guó)豪.肝癌中乙型肝炎病毒整合位點(diǎn)的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（18）：1249-1252.

［17］Sung WK，Zheng H，Li S，et al.Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma［J］.Nat Genet，2012，44（7）：765-769.

［18］吳殿磊，徐光華，劉娜.HBV DNA整合與慢性乙型肝炎、原發(fā)性肝癌關(guān)系研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2015，23（29）：4658-4664.

［2017-03-31收稿］［2017-04-15修回］［編輯江德吉］

Analysis of hepatitis B virus X gene integration and potential risk factors of integration in patientsw ith hepatocellular carcinoma in the high-incidence area of Guangxi

Wu Hanghang1，2，Huang Tianren2，Deng Wei1，F(xiàn)ang Xiang1，2，Ren Jingjing1，2，Gan Yingyuan1，2（1Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com Deng Wei.E-mail：9608946@qq.com

Objective To analyze integration ofhepatitis B virus（HBV）X gene into the genome of primary hepatocellular carcinoma（HCC）tumors and surrounding tissue，and to explore potential risk factors of such integration in patients from the HCC high-incidence area of Guangxi.Methods DNA was extracted from HCC tissue and adjacent non-tumor liver tissue of 30 patientswith HBV-related HCC.Primers were designed to amplify the HBV X sequence and human Alu repeats by Alu-PCR，and PCR products were Sangersequenced.Results Among the 30 patients，18（60.00%）showed integration of the HBV X gene into HCC tumors，compared to 26（86.67%）who showed X gene integration into adjacent liver tissue（χ2=5.445，P=0.020）.Incidence of X gene integration did not vary significantly with sex，age，HbeAg status，HBV DNA load，ALT or AST in HCC tissue or adjacent non-tumorous liver tissue（P>0.05）. Conclusions Incidence of HBV integration is higher in non-tumorous tissues than in tumorous tissues in patients with HBV-related HCC in Guangxi.HBV integration appears to occur in early stages of HCC development.HBV X gene integration does not appear to be influenced by sex，age，HBeAg status，HBV DNA load，ALT or AST.

Hepatocellular carcinoma；Hepatitis B virus X gene；Integration；Guangxi

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660561，81260319）；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（KY2015ZD025，ZD2014039）

黃天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com鄧偉。E-mail：9608946@qq.com