付陸 趙明德 吳小燕 賈先波 賴(lài)松家

摘要 [目的] 研究TYK2基因在家兔腸炎發(fā)生中的遺傳效應(yīng)，探討其是否可以作為家兔抗病育種的輔助選擇標(biāo)記。[方法] 通過(guò)構(gòu)建病例組-對(duì)照組腸炎兔群和低纖維誘導(dǎo)的腸炎兔群，PCR產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，以及qRT-PCR法檢測(cè)TYK2基因在回腸和結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)水平。[結(jié)果] 發(fā)現(xiàn)TYK2基因外顯子區(qū)域有5個(gè)cSNP，只有c.1477（c.1477，C>T）位點(diǎn)發(fā)生非同義突變，導(dǎo)致氨基酸p.Leu 404 Phe（L>F）的改變，C等位基因增加了腸炎的易感性（OR：1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019），而等位基因T對(duì)腸炎的發(fā)生起到了一定的保護(hù)作用（OR：0.81，95% CI 0.352～0.960；P=0.018）。TYK2基因不同基因型和不同腸炎程度的mRNA水平均呈現(xiàn)差異表達(dá)（P<0.05）。[結(jié)論] TYK2（c.1477，C>T）是家兔腸炎易感風(fēng)險(xiǎn)基因，為家兔的抗病育種提供了一個(gè)可靠的輔助選擇標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 TYK2；腸炎；遺傳易感性

Investigation of Genetic Susceptibility of TYK2 Gene in Rabbit Enteritis

FU Lu1， 2， ZHAO Ming-de1， WU Xiao-yan1， LAI Song-jia2* et al

（1.Laboratory Animal Centre， Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan 646000；2.Institute of Animal Genetics， Sichuan Agricultural University，Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract [Objective] To study the genetic effects of TYK2 gene in rabbit enteritis and to explore whether it could be used as a Marker-Assisted Selection （MAS） for resistance breeding in rabbits. [Method] To construct case-control rabbit enteritis groups and low fiber induced rabbit enteritis groups， the PCR products were purified and sequenced directly， and the TYK2 gene mRNA levels in ileum and colon tissues were detected by qRT-PCR. [Result] Five cSNPs were detected in exon region of TYK2 gene， and only c.1477 （c.1477， C>T） loci was non synonymous mutation， which caused to the change of amino acid p.Leu 404 Phe （L>F）. The C allele increased the susceptibility of enteritis （OR： 1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019）， and the T allele was a protective effect on the occurrence of the enteritis （OR： 0.81， 95% CI 0.352～0.960；P=0.018）. The TYK2 mRNA levels in different genotypes and in different degree of enteritis both presented significant difference （P<0.05）. [Conclusion] TYK2 （c.1477， C>T） is a susceptible risk gene of rabbit enteritis， and provides a MAS for the resistance breeding.

Key words TYK2；Enteritis；Genetic susceptibility

家兔為人類(lèi)提供大量的優(yōu)質(zhì)肉、毛和皮等產(chǎn)品，隨著消費(fèi)的迅速增長(zhǎng)，規(guī)?；B(yǎng)兔成為發(fā)展的必然趨勢(shì)。然而，薛家兵等[1]、谷子林[2]報(bào)道患黏液性腸病的兔絕大部分死亡，發(fā)病率50%～70%，死亡率90%以上，一些兔場(chǎng)發(fā)病死亡率甚至高達(dá)100%。家兔腹瀉死亡的致病機(jī)理十分復(fù)雜，防治難度很大，被列入近幾年三大兔病之一（兔瘟、兔腸道疾病和體表真菌?。3]。因此，研究家兔腹瀉和腸炎的發(fā)病機(jī)制，從而控制死亡率已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)兔業(yè)中抗病育種的熱點(diǎn)。

TYK2（Tyrosine kinase 2）作為酪氨酸蛋白激酶家族（Janus kinases，JAKs）的一個(gè)重要成員，參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡[4]，介導(dǎo)機(jī)體免疫調(diào)控[5-6]和腫瘤生成等一系列生命活動(dòng)過(guò)程[7-8]。Minegishi等[5]研究發(fā)現(xiàn)TYK2基因純合子突變的病人被臨床診斷為高IgE綜合征，表明其在多種細(xì)胞因子的天然免疫和獲得性免疫中扮演重要作用。研究表明TYK2可以通過(guò)一種棕色脂肪組織（BAT）的分化來(lái)調(diào)控小鼠肥胖[9]。既然TYK2基因廣泛參與到上述生理生化反應(yīng)中，它是否在家兔腸炎發(fā)生中也扮演一定的作用，值得探索。

采用病例組-對(duì)照組試驗(yàn)設(shè)計(jì)擬在480只新西蘭兔中，篩選TYK2基因的編碼區(qū)SNP（cSNP），并剖析其中重要cSNP在家兔腸炎發(fā)生中的遺傳效應(yīng)；在低纖維日糧（CF=8.96%）誘導(dǎo)的60只新西蘭腸炎患病兔中，熒光定量PCR法檢測(cè)TYK2基因在回腸和結(jié)腸組織中的mRNA差異表達(dá)水平，為家兔抗病育種提供分子輔助選擇標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)兔群的構(gòu)建及樣本采取

選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)兔場(chǎng)飼養(yǎng)的新西蘭兔為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選擇35日齡健康無(wú)病、三代內(nèi)無(wú)親緣關(guān)系的480只新西蘭兔為試驗(yàn)動(dòng)物，構(gòu)建病例組-對(duì)照組腸炎易感性試驗(yàn)兔群。選取三代內(nèi)無(wú)親緣關(guān)系、胎次相近、健康無(wú)病、體重相當(dāng)?shù)?5日齡新西蘭斷奶仔兔60只，作為低纖維日糧腸炎試驗(yàn)兔群，飼喂低纖維飼料（CF=8.96%）。上述2個(gè)群體構(gòu)建的具體方法、分組情況及組織樣品采取參考Zhang等[10]的方法。

1.2 DNA和RNA的提取及檢測(cè)

試驗(yàn)采用DNA提取試劑盒AxyPrepTM Muitisource Genomic DNA Miniprep Kit（Axygen Biosciencs，USA），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，從家兔耳組織中提取全基因組DNA。試驗(yàn)采用Trizol法（Invitrogen），嚴(yán)格按照其說(shuō)明提取回腸和結(jié)腸組織總RNA。DNA和RNA的檢測(cè)方法相同，先進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，后用核酸蛋白儀進(jìn)行OD260/OD280值測(cè)定。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

根據(jù)NCBI提供的家兔TYK2基因參考序列（XM_017338771.1），設(shè)計(jì)3對(duì)引物（表1）進(jìn)行編碼區(qū)的擴(kuò)增。采用10 μL的反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mix（5 μL）、Forward primer/Reverse primer（各0.3 μL）、Template cDNA（0.8 μL）和ddH2O（3.6 μL）。將上述溶液混合后，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s、退火（具體的退火溫度由梯度PCR結(jié)果決定）30 s、72 ℃延伸60～90 s，擴(kuò)增35～38個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收純化后得到的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因測(cè)序中心測(cè)序。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

先使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Cat.# RR047Q，TaKaRa），進(jìn)行cDNA的合成，具體操作按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后采用2-△△CT法，以HPRT和GAPDH基因作為雙內(nèi)參，在CFX96TM Real-time System上檢測(cè)TYK2基因在回腸和結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)TYK2基因參考序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），由北京六合華大基因有限公司合成。按照SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，Dalian）試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)加樣，使用標(biāo)準(zhǔn)品作為板間對(duì)照，并設(shè)NTC，每個(gè)待測(cè)樣3個(gè)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

基因分型的個(gè)體數(shù)直接以n表示，mRNA相對(duì)表達(dá)量表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用SAS 9.2軟件分析TYK2基因與腸炎的遺傳效應(yīng)。運(yùn)用SPSS 19.0分析處理，組間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.05表示其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸炎炎癥程度的分類(lèi)

在60只低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸炎中（試驗(yàn)期間死亡和試驗(yàn)結(jié)束后屠宰），臨床癥狀評(píng)分（CSS）為2和3分的有40只，其中35只的剖檢癥狀分析評(píng)分（GLS）同樣較高，主要表現(xiàn)為食欲下降、腹部脹氣、盲腸內(nèi)容物結(jié)塊，大部分個(gè)體回腸內(nèi)有膠凍狀物質(zhì)（22/35），部分個(gè)體結(jié)腸伴隨著回腸出現(xiàn)膠凍狀物質(zhì)（17/35）。觀察組織病理切片發(fā)現(xiàn)各腸斷在發(fā)生嚴(yán)重腸炎時(shí)，都存在組織損傷和炎性損傷，并且回腸和結(jié)腸段病變得更為嚴(yán)重（圖1）?；疾〖彝玫幕啬c和結(jié)腸段，腸腔中未見(jiàn)紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)容物；腸絨毛多處毛細(xì)血管充血；部分腸上皮細(xì)胞壞死、溶解，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1b和d中①標(biāo)注）；腸絨毛中腸腺細(xì)胞發(fā)生壞死性溶解，可見(jiàn)嗜堿性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1b和d中②標(biāo)注）；黏膜固有層、黏膜下層結(jié)締組織間的間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1d中③標(biāo)注）。最終，將低纖維誘導(dǎo)試驗(yàn)兔群分為健康組（12只）、輕微腸炎組（13只）和嚴(yán)重腸炎組（35只）。

2.2 TYK2基因編碼區(qū)擴(kuò)增和直接測(cè)序結(jié)果

對(duì)新西蘭兔TYK2基因的外顯子區(qū)域，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳條帶單一，明亮致密，大小與目的條帶一致。將目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，送至北京六合華大基因公司進(jìn)行直接測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)cSNP，分別為c.1095（exon7，G>A），c.1477（exon9，C>T），c.2013（exon13，C>T），c.2133（exon14，T>C），c.2166（exon14，C>T），其中c.1477位點(diǎn)發(fā)生非同義突變，導(dǎo)致氨基酸p.Leu 404 Phe（L>F）的改變，其余的cSNP均為同義突變。

2.3 c.1477與家兔腸炎易感性分析

試驗(yàn)共選取了480只新西蘭兔（病例組253，對(duì)照組227），對(duì)c.1477位點(diǎn)采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純合CC型、TT型、雜合CT型在病例組和對(duì)照組中個(gè)體數(shù)分別為156/118，20/58，77/51。

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)在病例組和對(duì)照組中，C等位基因均處于優(yōu)勢(shì)地位，其頻率分別為76.88%和63.22%（P<0.05），而T等位基因分別為23.12%和36.78%（P<0.05）。2群體中基因型頻率CC（61.66% vs.51.98%），TT（7.91% vs.25.55%），CT（30.43% vs.22.47%）差異均顯著（P<0.05）。通過(guò)SAS 9.2軟件計(jì)算等位基因C增加了腸炎的易感性（OR：1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019），而等位基因T對(duì)腸炎的發(fā)生起到了一定的保護(hù)作用（OR：0.81，95% CI 0.352～0.960；P=0.018）。HWE評(píng)估檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組都遵循HWE平衡定律（P>0.05）。使用SNPStasts軟件評(píng)估5種遺傳模型對(duì)該突變的可靠性。根據(jù)AIC和BIC值的大小，確定隱性模型為這個(gè)位點(diǎn)的最適模型。利用這個(gè)模型，關(guān)聯(lián)性分析表明C/C基因型增加了腸炎的易感性（OR：1.73；95% CI 1.870～2.800；P<0.001）（表2）。

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