瞿印權 徐雯 何天友

摘要 近年來，分子標記技術已經在竹亞科植物種質資源鑒定、遺傳圖譜構建、基因定位以及良種選育中得到較為廣泛的運用。介紹了常用的分子標記技術及其在竹亞科植物遺傳多樣性研究中的應用，指出今后應加強分子標記技術在竹亞科植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、種質資源的鑒定、輔助選擇育種等方面的研究。

關鍵詞 竹亞科植物；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號 S188+.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0141-03

Abstract In recent years， molecular marker technology has been widely applied to Bambsoideae for identification of germplasm resources， construction of genetic maps， gene mapping and breeding of various crops . The several of molecular markers and application in the study of genetic diversity of Bambsoideae had been discussed in the present article. It has been suggested that the application of molecular markers should be strengthened for the construction of genetic maps， genetic analysis， identification of germplasm and marker assistedselection.

Key words Bambsoideae；Molecular marker；Genetic diversity

地球上的竹類植物共有88屬1 400多種，主要分布在亞太區(qū)、美洲區(qū)和非洲區(qū)三大塊[1]。我國竹類主要分布于長江中下游，其中以福建、浙江、江西、湖南4省最多，占全國竹林面積的60.7%。竹亞科植物具有繁殖生長快、根系發(fā)達、適應性廣等特點。近些年，我國關于竹亞科植物在分子生物方面的研究逐漸增多。

遺傳標記作為基因型易于識別的表現(xiàn)形式，在植物種質資源的開發(fā)與利用上具有重要作用。目前應用較為廣泛的遺傳標記主要有形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記、分子標記等。隨著現(xiàn)代植物分子生物學的快速發(fā)展，DNA分子標記技術被廣泛應用于遺傳多樣性的研究，其特點在于可以在各個發(fā)育時期的個體、各個組織器官進行檢測，不受環(huán)境與基因表達與否的限制，信息量大，遺傳穩(wěn)定，多態(tài)性高，分子標記可以散布整個基因組。目前，在竹亞科植物中已報道的DNA分子標記主要有ISSR、RAPD、AFLP、SSR共4種，擬對其應用研究進展進行總結，為竹亞科植物的良種選育提供參考。

1 遺傳多樣性研究的意義

從本質上講，遺傳多樣性就是生物體遺傳物質的變異，是生物進化的源泉，是物種適應自然環(huán)境的基礎。一個居群或物種所蘊含著所有生命過程信息，遺傳多樣性信息越豐富，其對外界周圍環(huán)境的適應能力越強，越容易拓展生存分布范圍。任何遺傳多樣性的丟失，都會導致該物種對環(huán)境變化適應能力的降低以及抵抗疾病能力的降低，同時也使人類喪失了具有潛在應用價值的生物信息和資源[2]。大量研究證明，生物居群中遺傳變異大小與進化速率成正比，因此對物種進行遺傳多樣性研究可為進一步分析物種或群居生物演變進化的歷史、方式、適應潛力，以及未來命運提供重要信息，有助于對物種稀有或瀕危原因及過程的探索[3]；同時也有助于物種間或種群間親緣關系的確定，為動植物的分類、進化研究提供重要資料，為系統(tǒng)發(fā)育、分類系統(tǒng)的建立提供理論依據(jù)，為植物優(yōu)良育種奠定基礎[4]。再者，通過遺傳多樣性研究，確定物種種內遺傳變異大小、時空及其與分布環(huán)境條件的關系，有助于制定更加有效的物種保護策略，保護遺傳多樣性位點和延遲瀕危物種滅絕的進度[5-6]。

綜上，遺傳多樣性的研究對物種起源和進化歷史的探索，動植物的分類、遺傳改良，動植物種質資源的保護具有重要理論與現(xiàn)實意義。

2 遺傳多樣性的研究方法

遺傳多樣性是生物多樣性最重要也是最基礎的一部分，是生物進化與分類的重要依據(jù)[7]。隨著生物實驗技術的發(fā)展和生物研究水平的提高，遺傳多樣性的檢測方法日益多樣化，可以從不同的角度和層次來揭示物種變異情況。遺傳多樣性的標記方法可以從以下4個水平進行分析與研究：形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記、分子標記，以下對分子標記做主要介紹。

分子標記（Molecular marker）是指以生物體內遺傳物質DNA的多態(tài)性為基礎的遺傳標記。自20世紀80年代中期以來，分子標記技術的飛速發(fā)展使人們對遺傳多樣性的研究上升到DNA水平，DNA是遺傳物質的載體。物種的遺傳信息可以反映在DNA堿基的序列結構上，因此生物物種的遺傳多樣性研究就是基于DNA堿基序列的觀察與分析。與形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記相比，分子標記具有以下幾個優(yōu)越性：①直接以DNA的形式存在，在生物的各個組織、各個發(fā)展階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境和生物體自身因素的影響，不存在表達與否的問題；②分子標記的數(shù)量是無限的，遍布整個基因組，用很少量的葉片或種子就可以完成整個分子標記過程；③多態(tài)性高，自然界存在著許多等位基因變異，不需要人為創(chuàng)造特殊的遺傳材料；④表現(xiàn)為中性，既不影響目標性狀的表達，也與不良基因沒有必然的連鎖關系?；谝陨蟽?yōu)點，分子標記被廣泛應用于植物分子遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性的分析和種質資源的鑒定、基因定位、關聯(lián)遺傳學等方面[8]。目前分子標記主要分為3類：第1類是以雜交為基礎的分子標記，其主要是RFLP（Restriction fragment length polymorphism）限制性片段長度多態(tài)性；第2類是以PCR為基礎的分子標記，主要包括RAPD（Random amplification polymorphic DNA）隨機擴增多態(tài)性、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）擴增片段長度多態(tài)性、SSR（Simple sequence repeat）簡單重復序列和ISSR（Inter simper sequence repeat）內部簡單重復序列；第3類是指以單個核苷酸變異為核心的分子標記，其主要是SNP（Single nucleotide polymorphisms）單核苷酸多態(tài)性[9]。以下就幾種常用分子標記進行介紹。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性標記（RFLP） RFLP是較早應用于基因標記的分子標記技術，由Bostein于1980年提出。其原理是利用限制性內切酶切割樣品基因組DNA，酶切后會產生許多大小、長度不一的限制性DNA片段，通過電泳再利用雜交技術和DNA探針相結合，這樣產生的雜交帶便能在放射性自顯影中顯示出來，從而檢測到不同遺傳位點的等位變異情況，呈現(xiàn)不用材料DNA限制性片段多態(tài)性圖譜。RFLP標記可以提供大量的標記，且不受外部環(huán)境、組織特異性的干擾，具有結果穩(wěn)定可靠、重復性好、共顯性等優(yōu)點，但其需要大量的樣品DNA且要求材料組織足夠新鮮[10]。

2.2 隨機擴增多態(tài)性標記（RAPD）

RAPD是由Williams和Welsh于1990年分別研究提出的運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標記[11-12]。其原理是以基因組DNA為模板，利用一個隨機寡核苷酸序列（一般為10個堿基）為引物，通過PCR擴增反應，產生的片段DNA產物經電泳檢測分離后，再用放射性自顯影技術或EB染色法檢測該研究對象的多態(tài)性譜帶。RAPD標記所需DNA用量少、操作簡單、檢測方便、敏感性高；引物是隨機合成，不需要參照物種的基因組序列就可以設計引物，一個引物可以擴增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組。但用于RAPD標記的引物都很短，導致退火溫度低，容易引起引物和模板DNA的錯配現(xiàn)象，因此實驗重復性差[13]。

2.3 擴增片段長度多態(tài)性標記（AFLP）

AFLP是由Zabeau和Vos于1993年創(chuàng)建的基于RELP和RAPD的，可以選擇性地擴增限制性片段的分子標記技術。其原理是利用限制性內切酶切割基因組DNA，形成酶切DNA片段后，再將雙鏈人工接頭連接在DNA片段兩端，作為擴增反應模板，以接頭序列和相連的酶切片段堿基序列作為引物結合位點，然后選擇性地擴增某些酶切片段，擴增片段經聚丙烯酞胺凝膠電泳分離、檢測。AFLP標記的引物是人工合成的且具有通用性，不需要知道DNA序列信息；多態(tài)性非常高，不同的限制性內切酶組合在理論上可以有無限多個多態(tài)性位點；擴增片段短，因此分辨率高。但AFLP標記操作過程復雜，費用昂貴且對基因組DNA和限制內切酶的質量要求較高[14]。

2.4 簡單重復序列標記（SSR）

SSR是由Moore和Sollotterer等于1991年提出的廣泛分布在真核生物中，由1～6個核苷酸為單位組成的短的、串聯(lián)的單拷貝序列，又稱為微衛(wèi)星[15]。其原理是根據(jù)微衛(wèi)星兩端的序列設計一對特異的引物，通過PCR擴增出核心微衛(wèi)星DNA序列，再利用電泳分離、檢測每個SSR位點上的多態(tài)性[16]。SSR位點遍布整個基因組DNA，提供豐富信息，該技術可檢測較高的多態(tài)性；SSR側翼序列保守，有助于提高引物設計效率[17]。SSR標記表現(xiàn)為復位共顯性標記且該方法測定速度快、重復性好[18]，但SSR技術的引物設計需要預知基因的序列，使得研究費用和條件較高。

2.5 內部簡單重復序列（ISSR）

ISSR分子標記是在SSR序列的基礎上，加上1～4個核苷酸作為ISSR-PCR反應的引物，從而使DNA序列放大，表現(xiàn)出較高的重復性和穩(wěn)定性[19]。SSR序列在高等生物的染色體內廣泛存在，所以利用ISSR技術可以得到較多的分子標記，呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性[20]。ISSR分子標記技術兼有SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優(yōu)點，因其穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、多態(tài)性好、產物特異性強等特點[21]，現(xiàn)已被廣泛應用于植物的種質收集、品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、標記輔助選擇等諸多領域[22]。

2.6 單核苷酸多態(tài)性標記（SNP）

SNP最早在1994年人類分子遺傳學雜志上出現(xiàn)，1996年Lander第一次正式提出SNP是繼RFLP、SSR之后的又一種新型分子標記[23]。SNP是指生物基因組DNA中個別單核苷酸變異引起的多態(tài)性，這些變異包括堿基的轉換和顛換或只有小的插入和缺失，大約2/3的SNP標記是由單個同類堿基的轉換引起的[24]。SNP具有分布最廣泛、標記數(shù)目多且穩(wěn)定性高、二態(tài)性等特點。

3 DNA分子標記在竹亞科植物中的應用

3.1 遺傳多樣性分析

研究竹亞科植物的遺傳多樣性對竹亞科各屬植物保護、良種選育、種質資源的遺傳改良具有重要意義。Desai等[25]應用RAPD和ISSR方法對生長于印度13個基因型竹種進行遺傳多樣性研究，30條RAPD引物共擴增出645個條帶，其中多態(tài)性條帶623個，平均每個引物擴增20.76個條帶；12條ISSR引物共擴增出246個條帶，其中多態(tài)性條帶241個，平均每個引物擴增20.08個條帶。該數(shù)據(jù)表明不同基因型竹種間存在著豐富的遺傳多態(tài)性。Yang等[26]運用ISSR技術對黃竹（Dendrocalamus membranaceus Munro）云南自然分布區(qū)內的12個種群進行遺傳多樣性分析，10條ISSR引物共擴增出155個條帶，其中153個為多態(tài)性條帶（98.71%），表明黃竹種群間存在豐富的遺傳多樣性（0.349）和較低水平的遺傳分化（0.252）。

3.2 指紋圖譜構建

由于DNA分子標記可以覆蓋整個基因組，能客觀地反映各竹種以及竹種各種群DNA水平的差異，因此竹亞科各屬植物指紋圖譜的建立，有助于各種質資源之間的相互鑒定。Qu等[27]利用18個引物分析30個竹亞科各屬竹種的遺傳多樣性，并針對每一個竹種建立唯一的指紋圖譜庫，為竹亞科各竹種分類奠定基礎。吳益民等[28]借助RAPD技術分析孝順竹（Bambusa multiplex）、鳳尾竹[Bambusa multiplex var.nana（Roxb.）Keng f.]、綠竹（Dendrocalamopsis oldhami）、白綠竹（Bambusa multiplex）4個品種的遺傳多樣性，首次構建反映種特征的RAPD指紋圖譜，為4個竹種鑒定提供分子水平的科學依據(jù)。

3.3 親緣關系鑒定及分類

根據(jù)遺傳距離或遺傳相似系數(shù)進行聚類分析，并建立聚類樹狀圖，區(qū)分竹種或各種群，研究聚類結果有無明顯地域特征。Tian等[29]利用ISSR技術分析了龍竹（Dendrocalamus giganteus Munro）7個種群間的親緣關系，并且按照親緣關系將7個種群分成2組。Baishya等[30]利用RAPD技術對印度東北地區(qū)30個竹種進行親緣關系鑒定，并采用UPGMA聚類法將竹種分成3組。Friar等[31]應用RFLP技術對26種竹子的42個不同基因型進行DNA多態(tài)性研究，根據(jù)品種間親緣關系遠近，鑒定出其中25種為散生竹。

4 結語

竹亞科植物廣泛生長于我國南方省市。叢生竹林在生物固碳領域有著巨大作用，同等面積下的竹林較樹林可多釋放出35%的氧氣，具有很好的生態(tài)效益。竹亞科植物具有繁殖生長快、根系發(fā)達、蓄水保土、適應性廣等特性，在沿海沙地引種，與木麻黃、馬尾松進行混交種植形成沿海防護林，可以起到防風固沙效果。由于我國南部沿海常年受臺風、風暴潮等自然災害影響，因此加強沿海防護林系統(tǒng)建設避免更大的經濟和生命損害十分有必要。首先要做的就是保護它們的遺傳多樣性，選擇遺傳多樣性水平更高的竹亞科植物是關鍵。

DNA分子標記技術，為竹亞科品種和種源的鑒定提供了更為準確、可靠、方便的方法，與形態(tài)標記、生化標記相比，DNA分子標記技術具有獨到之處：竹亞科植物的任何組織在任一發(fā)育時期均可用于分析；每一位點總存在多態(tài)性，遺傳穩(wěn)定，既能探索品種間染色體組孟德爾遺傳因子方面的差異，又能揭示母體細胞質方面的非孟德爾遺傳因子的影響；分子標記的數(shù)量是無限的，遍布整個基因組，用很少量的葉片或種子就可以完成整個分子標記過程；DNA分子標記不受任何環(huán)境因素、生物體自身因素的影響，因為環(huán)境只影響基因表達轉錄與翻譯，而不改變基因結構；分離出的樣品DNA在適宜條件下可長期保存?；谝陨蟽?yōu)點，分子標記可被廣泛應用于植物分子遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性的分析、種質資源的鑒定、基因定位、關聯(lián)遺傳學等方面。

參考文獻

[1] 羅振沖.大頭典竹的筍用價值和栽培技術[J].農業(yè)研究與應用，2008（6）：38-39.

[2] RYALL C.Principles of conservation biology[J].Environmentalist，1998，19（2）：171.

[3] 張德全，楊永平.幾種常用分子標記遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計分析[J].植物分類與資源學報，2008，30（2）：159-167.

[4] 黃焱.珍珠黃楊遺傳多樣性及其資源保護與利用[D].南京：南京林業(yè)大學，2008.

[5] 劉志齋，吳迅，劉海利，等.基于40個核心SSR標記揭示的820份中國玉米重要自交系的遺傳多樣性與群體結構[J].中國農業(yè)科學，2012，45（11）：2107-2138.

[6] HAN J P，ZHANG W S，CAO H B，et al.Genetic diversity and biogeography of the traditional Chinese medicine，Gardenia jasminoides，based on AFLP markers[J].Biochemical systematics & ecology，2007，35（3）：138-145.

[7] 崔朝霞，張峘，宋林生，等.中國重要海洋動物遺傳多樣性的研究進展[J].生物多樣性，2011，19（6）：815-833.

[8] 平俊愛，張福耀，呂鑫，等.DNA分子標記技術及其在高粱育種中的應用[J].中國農學通報，2011，27（5）：33-39.

[9] GROVER A，SHARMA P C.Development and use of molecular markers：Past and present[J].Critical reviews in biotechnology，2016，36（2）：290.

[10] YANG W P，OLIVEIRA A C D，GODWIN I，et al.Comparison of DNA marker technologies in characterizing plant genome diversity：Variability in Chinese Sorghums[J].Crop Science，1996，36（6）：1669-1676.

[11] WELSH J，MCCLELLAND M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic acids research，1990，18（24）：7213-7218.

[12] 劉曉宇.RAPD分子標記技術概述及應用[J].科技創(chuàng)新與生產力，2010（9）：98-99.

[13] 陳良華，胡庭興，張帆.核桃與鐵核桃種間關系的RAPD鑒定[J].四川農業(yè)大學學報，2007，25（4）：513-516.

[14] 劉靜.AFLP分子標記的發(fā)展及應用[J].山東農業(yè)科學，2010（5）：10-14.

[15] 吳鶯鶯.油茶種質資源遺傳多樣性分析及品種鑒定[D].南京：南京林業(yè)大學，2011.

[16] YUAN Y，LONG P，JIANG C，et al.Development and characterization of simple sequence repeat（SSR）markers based on a fulllength cDNA library of Scutellaria baicalensis[J].Genomics，2015，105（1）：61-67.

[17] 詹少華，盛新穎，樊洪泓，等.大豆二核苷酸SSR側翼序列保守性分析[J].大豆科學，2010，29（2）：195-198.

[18] GONZAGA Z J，ASLAM K，SEPTININGSIH E M，et al.Evaluation of SSR and SNP markers for molecular breeding in rice[J].Plant breeding & biotechnology，2015，3（2）：139-152.

[19] IZZATULLAYEVA V，AKPAROV Z，BABAYEVA S，et al.Efficiency of using RAPD and ISSR markers in evaluation of genetic diversity in sugar beet[J].Turkish journal of biology，2015，38（4）：429-438.

[20] REDDY M P，SARLA N，SIDDIQ E A.Inter simple sequence repeat（ISSR）polymorphism and its application in plant breeding[J].Euphytica，2002，128（1）：9-17.

[21] SUDUPAK M A.Inter and intraspecies Inter Simple Sequence Repeat（ISSR）variations in the genus Cicer[J].Euphytica，2004，135（2）：229-238.

[22] 謝玥，潘美玲，莊啟國，等.紅陽獼猴桃及其雜交后代的ISSR指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[J].基因組學與應用生物學，2013，32（1）：76-82.

[23] LANDER E S.The new genomics：Global views of biology[J].Science，1996，274（5287）：536-539.

[24] 王俊.枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）SNP位點篩選及遺傳多樣性分析[D].重慶：西南大學，2013.

[25] DESAI P，GAJERA B，MANKAD M，et al.Comparative assessment of genetic diversity among Indian bamboo genotypes using RAPD and ISSR markers[J].Molecular biology reports，2015，42（8）：1265-1273.

[26] YANG H Q，AN M Y，GU Z J，et al.Genetic diversity and differentiation of Dendrocalamus membranaceus（Poaceae：Bambusoideae），a declining bamboo species in Yunnan，China，as based on InterSimple Sequence Repeat（ISSR）analysis[J].International journal of molecular sciences，2012，13（4）：4446-4457.

[27] QU Y Q，CHEN S K，SONG K P，et al.Genetic diversity and DNA fingerprint of 30 bamboo species using ISSR markers[J].Journal of jiangsu forestry science & technology，2017，44（1）：1-6.

[28] 吳益民，黃純農，王君暉.四種竹子的RAPD指紋圖譜的初步研究[J].竹子研究匯刊，1998（3）：10-14.

[29] TIAN B，YANG H Q，WONG K M，et al.ISSR analysis shows low genetic diversity versus high genetic differentiation for giant bamboo，Dendrocalamus giganteus（Poaceae：Bambusoideae），in China populations[J].Genetic resources & crop evolution，2012，59（5）：901-908.

[30] BAISHYA S，RATHI S，SARMA A.Genetic variation in Bamboo species of North East India through RAPD[J].Indian journal of agricultural biochemistry，2016，29（1）：36.

[31] FRIAR E，KOCHERT G.A study of genetic variation and evolution of Phyllostachy（Bambusoideae：Poaeeae） using nulear restriction fragment length polymorphisms[J].Theoretical and applied genetics，1994，（89）：265-270.