陳康勇 彭芳 薛竣仁 鐘為銘 高志鵬

摘要 [目的]研究單增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培養(yǎng)生物膜，分別采用結(jié)晶紫染色法和光學(xué)顯微鏡進行生物膜的定量和定性研究，觀察在不同培養(yǎng)時間（8、16、24、32、40、48 h）單增李斯特氏菌生物膜的形成狀況。[結(jié)果]隨著培養(yǎng)時間的增加，單增李斯特氏菌生物膜生物量逐漸增加，生物膜經(jīng)歷了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部過程。[結(jié)論]試驗結(jié)果為單增李斯特氏菌生物膜相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 單核細胞增生李斯特氏菌；生物膜；形成特性

Biofilm Formation Characteristics of Listeria monocytogenes

CHEN Kang-yong1，PENG Fang1，XUE Jun-ren1，GAO Zhi-peng1，2* et al （1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128； 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde，Hunan 415000）

Abstract [Objective]The aim was to investigate the biofilm formation characteristics of Listeria monocytogenes. [Method]To investigate the characteristics of Listeria monocytogenes biofilm at different incubation times （8，16，24，32，40，48 h），24-well plate method was used to cultivate biofilm，and quantitative and qualitative data were obtained by crystal violet staining assay and light microscopy.[Result]With the increase of culture time，the biomass of Listeria monocytogenes biofilm increased gradually，and the biofilm went through the process of adhesion，microcolony formation，macrocolony formation to mature.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the related research of Listeria monocytogenes biofilm.

Key words Listeria monocytogenes；Biofilm；Formation characteristics

生物膜（BF）是細菌為了適應(yīng)生存環(huán)境，黏附于非生物或者活性組織的表面，包被于自身分泌的胞外基質(zhì)中，形成的一種三維聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細菌生物膜是一種和浮游生長對應(yīng)的生長方式[1-3]。生物膜參與65%以上的感染，尤其是與醫(yī)療器械相關(guān)的、機體表面的（如皮膚、軟組織等）和慢性感染，原因主要是生物膜對宿主防御和抗菌藥物具有很強的抵御能力[4-6]。生物膜是細菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因，可使細菌的耐藥性提高10～1 000倍[7-8]。生物膜感染已成為全球關(guān)注的問題。

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種能在冷藏的溫度下進行繁殖的致病菌，由于該細胞的苯酚-水浸出物能夠誘導(dǎo)單核細胞生成，所以被命名為“單核增生細菌”[9]。人或者牲畜感染之后主要表現(xiàn)出敗血癥、胃腸炎、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀[10]。嬰幼兒、老年人以及免耐受病人的臨床死亡率約為30%[11]。該菌種在自然界廣泛存在，對于不利的生長環(huán)境條件具有很強的耐受能力，在4 ℃冰箱中可生長繁殖，所以各類冷凍食品均成為被感染對象，如肉制品、奶制品、冰激凌等[12]。在對含有單增李斯特氏菌的乳制品進行超高壓處理研究中發(fā)現(xiàn)，在500 MPa、10 min、20 ℃下處理乳制品，雖然能夠降低其單增李斯特氏菌活菌量，但仍有細菌存活并繁殖[13]。同時，單增李斯特氏菌對水產(chǎn)品也具有較高的污染程度[14-15]。單增李斯特氏菌所產(chǎn)生的生物膜可保護其不受抗菌藥物作用，并且能降低機體免疫細胞的吞噬作用。試驗表明，在任何溫度條件下，單增李斯特氏菌可在固體表面形成生物膜，并且能夠在很長時間黏附于固體表面，其生物膜的形成引起了食品、用品衛(wèi)生安全的隱患[16]。

單增李斯特氏菌生物膜所導(dǎo)致的相關(guān)性疾病患病率逐年上升，至今很少有藥物能有效控制該類感染，深入研究單增李斯特氏菌生物膜形成特性，對于尋找有效的防治藥物和方法具有重要意義。筆者研究了單增李斯特氏菌生物膜的形成過程，以期為單增李斯特氏菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌。單核細胞增生李斯特氏菌（編號：ATCC19115），購自廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑。LB肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、技術(shù)瓊脂粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、0.1%結(jié)晶紫溶液（Sigma公司）、95%乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛（Sigma公司）。

1.1.3 主要儀器。

熒光多功能酶標儀、光學(xué)顯微鏡、24孔和96孔細胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋和高速彩色平臺掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特氏菌生物膜培養(yǎng)。

采用24孔板法，具體操作：取單個單增李斯特氏菌菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取10 μL 菌液轉(zhuǎn)接至預(yù)先加入無菌蓋玻片（12 mm）和2 mL 新鮮LB培養(yǎng)液的24孔細胞培養(yǎng)板中，然后37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.2.2 不同培養(yǎng)時間對單增李斯特氏菌生物膜形成特性的影響。

按培養(yǎng)時間分別設(shè)置8、16、24、32、40、48 h 6個試驗組，每組分別做6個平行，按照“1.2.1”進行生物膜培養(yǎng)，在上述時間點進行結(jié)晶紫染色試驗和顯微鏡觀察。

1.2.3 單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色試驗。

利用生物膜內(nèi)物質(zhì)可與特殊染料結(jié)合的原理，通過染色的方法對生物膜進行定性或定量分析。單增李斯特氏菌生物膜形成后，將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，吸出培養(yǎng)液，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min，棄固定液，并用無菌PBS浸洗3次，洗去浮游菌，使黏附在蓋玻片的生物膜自然風(fēng)干，室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸除染色液后，用無菌PBS浸洗3次，自然風(fēng)干，然后用高速彩色平臺掃描儀掃描拍照。

1.2.4 單增李斯特氏菌生物膜生物量的測定。

單增李斯特氏菌生物膜形成后，吸出培養(yǎng)液，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，每孔加入200 μL 95%乙醇，置于搖床30 min使結(jié)晶紫完全溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板中，并用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度，即OD540，每個試驗重復(fù)3次。

1.2.5 顯微鏡觀察單增李斯特氏菌生物膜。

方法同“1.2.3”，結(jié)晶紫染色后，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后置于100倍油鏡下觀察生物膜的形成狀況，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間下單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特氏菌生物膜的形成分為4個階段，即黏附階段、微菌落形成階段、大菌落形成階段和成熟階段。①黏附階段（0～16 h）：細菌逐漸聚集并黏附于介質(zhì)（蓋玻片）表面，生物膜形成速度較慢；②微菌落形成階段（17～24 h）：生物膜結(jié)晶紫染色較淺，微菌落開始形成，并呈斑塊狀分布；③大菌落形成階段（25～32 h）：細菌聚集明顯，生物膜斑塊變大，32 h時布滿蓋玻片，結(jié)晶紫染色加深；④成熟階段（33～48 h）：結(jié)晶紫染色比前32 h明顯加深，生物膜斑塊更加密集，厚度增大，40 h時生物膜基本形成，33～48 h形成的生物膜的OD540快速增長。隨著培養(yǎng)時間的增加，單增李斯特氏菌的生物膜呈現(xiàn)出從黏附聚集到成熟的過程，于48 h達到最成熟的狀態(tài)（圖1、2）。

2.2 不同培養(yǎng)時間下單增李斯特氏菌生物膜顯微觀察結(jié)果

①黏附階段：在物鏡為100倍的顯微鏡下可觀察到生物膜的厚度小，菌落間的通道多，說明生物膜形成并不成熟。②微菌落形成階段：微菌落開始形成，生物膜斑塊數(shù)量增多，生物膜的厚度開始增加，菌落間通道變少。③大菌落形成階段：結(jié)晶紫染色變深，開始形成較為致密的生物膜，但生物膜斑塊比較分散，菌落間通道繼續(xù)變少。④成熟階段：生物膜斑塊大量增加并且形成了牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，生物膜厚度明顯增加，染色顯著加深，培養(yǎng)至48 h時生物膜極厚，菌落之間幾乎沒有通道，生物膜完全成熟（圖3）?？梢?，生物膜形成期間，菌落間的通道不斷減少，生物膜斑塊逐漸增加并且密集，生物膜的厚度逐漸增加，并趨于成熟。

3 討論

細菌生物膜的形成是一個動態(tài)過程，隨著細菌的生長，生物膜對營養(yǎng)因子的通透性變差，同時細菌也開始老化甚至失去了成膜能力。進入成熟期后，隨著生存環(huán)境中營養(yǎng)等限制因子的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累，細菌的生長開始受到限制，生物膜的形成達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，此時生物膜的厚度基本穩(wěn)定。進入衰老期后，伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，生物膜中細菌的大部分蛋白質(zhì)和RNA的合成速率降低，致使胞外多糖的合成量減少，生物膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)崩解甚至細菌也開始從生物膜表面脫落，再次成為游離菌，使生物膜的厚度減少。

單增李斯特氏菌生物膜的形成是一個復(fù)雜的過程，涉及到多種蛋白、核酸分子和多糖等因素，同時也受到各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共同作用。深入研究單增李斯特氏菌生物膜的形成和調(diào)控的分子機制對尋找特異性干預(yù)靶點具有重要意義。該試驗?zāi)壳爸皇茄芯颗囵B(yǎng)時間對單增李斯特氏菌生物膜形成的影響，主要是通過觀察細菌生物膜的形成情況來說明培養(yǎng)時間對生物膜的影響，后續(xù)試驗還可研究環(huán)境因素對單增李斯特氏菌生物膜基質(zhì)組成的影響，通過觀察環(huán)境因素對生物膜中蛋白質(zhì)、胞外多糖、胞外DNA組成的影響，進一步探究單增李斯特氏菌生物膜的形成機制。

4 結(jié)論

采用24孔板法和結(jié)晶紫染色法研究單增李斯特氏菌生物膜的形成過程，發(fā)現(xiàn)在靜置培養(yǎng)條件下的單增李斯特氏菌生物膜的形成經(jīng)歷了4個階段，0～16 h為細菌黏附階段，17～24 h為微菌落形成階段，25～32 h為大菌落形成階段，33～48 h為成熟階段。細菌黏附階段，菌落間的通道多，形成生物膜速度慢。微菌落形成階段，隨著培養(yǎng)時間的延長，生物膜結(jié)晶紫染色顏色變深，細菌開始形成微菌落，但形成速度較慢，并開始形成生物膜斑塊。大菌落形成階段，細菌形成的大量微菌落聚集成大菌落，生物膜斑塊增大，開始形成較為致密的生物膜，結(jié)晶紫染色快速變深。成熟階段，生物膜斑塊快速增大并且密集，形成了具有牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)的生物膜，菌落間的通道不斷減少。培養(yǎng)48 h期間，單增李斯特氏菌生物膜的生物量隨培養(yǎng)時間的增加而增大，表明細菌生物膜的生長經(jīng)歷了從黏附聚集到成熟的過程，在48 h生物膜生長達到完全成熟的狀態(tài)。

參考文獻

[1] HALL-STOODLEY L，STOODLEY P.Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens[J].Trends in microbiology，2005，13（1）：7-10.

[2] 袁海蘭，蘇建，胡鯤，等.環(huán)境因子對水霉菌生物膜形成的影響[J].微生物學(xué)通報，2014，41（9）：1829-1836.

[3] 徐文生，張艷艷，黃漫青，等.環(huán)境因素對長雙歧桿菌CICC6069生物膜生成的影響[J].中國食品學(xué)報，2012，12（4）：36-42.

[4] COSTERTON J W，STEWART P S，GREENBERG E P.Bacterial biofilms：A common cause of persistent infections[J].Science，1999，284（5418）：1318-1322.

[5] O′TOOLE G，KAPLAN H B，KOLTER R.Biofilm formation as microbial development[J].Annual review of microbiology，2000，54（1）：49-79.

[6] KOLTER R.Biofilms in lab and nature：A molecular geneticist′s voyage to microbial ecology[J].International microbiology，2010，13（1）：1-7.

[7] 祝司霞.細菌生物膜的結(jié)構(gòu)及形成機制的研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，17（2）：115-117.

[8] EHRLICH G D，AHMED A，EARL J，et al.The distributed genome hypothesis as a rubric for understanding evolution in situ during chronic bacterial biofilm infectious processes[J].FEMS immunology and medical microbiology，2010，59（3）：269-279.

[9] 馬里奧特.食品衛(wèi)生原理 [M].4版.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.

[10] 呂素玲，譚冬梅，李秀桂.廣西食源性單核細胞增生李斯特菌耐藥趨勢分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，20（6）：734-735.

[11] MARIJA Z，KONRAD J D，WOLFGANG K.Practical relevance of methodologies for detecting and tracing of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods and manufacture environments：A review[J].LWT-Food science and technology，2011，44（2）：351-362.

[12] LEMON K P，F(xiàn)REITAG N，KOLTER R.The virulence regulator PrfA promotes biofilm formation by Listeria monocytogenes[J].Journal of bacteriology，2010，192（15）：3969-3976.

[13] STEPANOVIC′ S，VUKOVIC′ D，DAKIC′ I，et al.A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J].Journal of microbiological methods，2000，40（2）：175-179.

[14] 張海英，羅茂凰，高旗利，等.食品中單核細胞增生李斯特氏菌的污染概況及防制[J].食品研究與開發(fā)，2003，24（6）：154-156.

[15] 鄭俏慧.凍水產(chǎn)品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗研究[J].食品工程，2010 （1）：58-60.

[16] 劉彤，陳晶瑜，韓北忠，等.單核增生李斯特氏菌生物被膜的形成及控制[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（2）：163-166.