齊琦+張配+李其響+潘瓊+鄭海倫+趙素容

[摘要] 冬凌草甲素是從中藥冬凌草Rabdosia rubescens中分離得到的一種貝殼杉烯二萜類的天然有機(jī)化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性。該實(shí)驗(yàn)觀察冬凌草甲素對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。采用MTT法檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用，PI單染、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析冬凌草甲素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，活性氧（ROS）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，Western blot分析PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，顯著升高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)caspase-3及其底物PARP的切割。提示，冬凌草甲素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用可能與升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)以及激活caspase-3相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌； 冬凌草甲素； 細(xì)胞凋亡； 活性氧

[Abstract] Oridonin， which is an ent-kaurene diterpenoid isolated from traditional Chinese medicine Rabdosia rubescens， displays various bioactivities， including anti-inflammation， anti-bacteria and anti-tumor. This study aimed to investigate the effect of oridonin on apoptosis of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and its underlying mechanisms. The inhibitory effect of oridonin on proliferation of MDA-MB-231 cells was measured by MTT assay； Apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining and Annexin V-FITC/PI staining； Intracellular reactive oxygen species （ROS） level was determined by ROS detection kit， and expressions of PARP， Bcl-2， caspase-3 were analyzed by Western blot. The results showed that oridonin exhibited a significant effect in inducing apoptosis of MDA-MB-231 cells， enhancing intracellular ROS level， down-regulating expression of Bcl-2 protein， and promoting cleavage of caspase-3 and its substrate PARP. These results indicated that the apoptosis-inducing effect of oridonin on MDA-MB-231 cells might be correlated with increase of intracellular ROS level， down-regulation of Bcl-2 protein and activation of caspase-3.

[Key words] breast cancer； oridonin； apoptosis； reactive oxygen

乳腺癌是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害女性健康與生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。近年來(lái)盡管其治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但乳腺癌在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率依然快速增長(zhǎng)[1]。目前，外科手術(shù)、放療和化療是乳腺癌最主要的治療手段。雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）均為陰性表達(dá)的乳腺癌，為三陰性乳腺癌（TNBC），該亞型的乳腺癌占乳腺癌病例數(shù)的12%～24%[2]。TNBC具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差等特征，并對(duì)內(nèi)分泌治療和抗HER2的靶向治療均不敏感[3-4]。因此，尋找新的作用機(jī)制的治療藥物對(duì)TNBC的治療具有重要意義。

冬凌草甲素是從中藥冬凌草Rabdosia rubescens中分離得到的一種貝殼杉烯二萜類的天然有機(jī)化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[5]。其中，抗腫瘤作用的研究受到了廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等顯示了良好的抗腫瘤效應(yīng)[6-8]，且毒副作用較低，尚未見(jiàn)對(duì)骨髓、肝臟、腎臟、心臟等重要臟器有明顯損傷作用的報(bào)道。該化合物以其顯著的抗腫瘤活性及低毒副作用等優(yōu)勢(shì)，顯示了作為新型抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景[9-10]。但冬凌草甲素抗腫瘤作用的具體機(jī)制并不明確。近年來(lái)，有研究表明某些化療藥物或化合物可通過(guò)升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平殺傷腫瘤細(xì)胞[11-12]。本實(shí)驗(yàn)將從ROS出發(fā)，探討冬凌草甲素誘導(dǎo)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；冬凌草甲素（Merck公司），以二甲基亞砜（DMSO）溶解；MTT，PI（Sigma公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（索萊寶公司）；ROS探針DCFH-DA，0.25%胰蛋白酶（碧云天生物技術(shù)研究所）；PARP，Bcl-2抗體（Santa Cruz公司）；caspase-3抗體（Abcam公司）；β-actin，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（博士德公司）。

1.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種6×10³個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后更換新的培養(yǎng)液，加入不同濃度（10，20，30，40，50 μmol·L^-1）冬凌草甲素處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不加藥物的對(duì)照組（加入等體積的培養(yǎng)液及溶劑DMSO）和空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。藥物處理48 h后每孔加入15 μL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度A。

細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3×10⁵個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后換液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培養(yǎng)液，設(shè)置不加藥物的對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。藥物作用24 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵～1×10⁶個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞，1 000 r·min^-1離心10 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次。將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，每個(gè)樣品中加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min，上機(jī)前5 min加入5 μL PI，混勻，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 PI染色法檢測(cè)總的細(xì)胞凋亡率 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3×10⁵個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后更換新的培養(yǎng)液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素處理細(xì)胞，設(shè)置不加藥物的對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。藥物處理48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，75%冷乙醇-20 ℃固定過(guò)夜。測(cè)試前用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于300 μL PI液中，室溫避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀分析具有subG₀/G1期DNA含量的細(xì)胞比例。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3×10⁵個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后更換新的培養(yǎng)液，加入20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素處理細(xì)胞，設(shè)置不加藥物的對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。藥物作用5 h后收集細(xì)胞，加入含10 μmol·L^-1 DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去掉未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度。

1.7 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 接種細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5×10⁵個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后換液加入含20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素的新培養(yǎng)液，設(shè)置不加藥物的對(duì)照組。藥物處理24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，每處理組細(xì)胞加入50 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)采用BCA法測(cè)定各處理組的蛋白濃度。每處理組取50 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE垂直電泳；蛋白采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；Western封閉液室溫封閉2～3 h；一抗室溫孵育1～3 h或4 ℃過(guò)夜；二抗室溫孵育1 h；ECL發(fā)光試劑盒顯影；Bio-Rad 凝膠成像儀曝光獲取圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，組間差異比較采用LSD檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，10～50 μmol·L^-1冬凌草甲素能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度增加其抑制作用越強(qiáng)（圖1）。

2.2 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞早期凋亡的影響 冬凌草甲素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h可誘導(dǎo)其發(fā)生早期凋亡。對(duì)照組細(xì)胞的早期凋亡率為（1.5±0.9）%，藥物處理組的細(xì)胞早期凋亡率隨著冬凌草甲素濃度的增加而升高，20，30，40 μmol·L^-1冬凌草甲素組的細(xì)胞早期凋亡率分別為（9.3±1.7）%，（15.4±2.1）%，（26.9±3.0）%，相比于對(duì)照組有顯著性差異（P<0.01）。

2.3 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞總的細(xì)胞凋亡的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組的總的細(xì)胞凋亡率為（1.3±0.6）%，20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡，總的細(xì)胞凋亡率分別為（19.4±2.7）%，（39.7±2.8）%，（50.5±3.2）%，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01）。

2.4 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細(xì)胞5 h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，冬凌草甲素能顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，隨著藥物濃度增加其升高ROS的作用越強(qiáng)（圖2）。

2.5 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白表達(dá)的影響 濃度為20，30，40 μmol·L^-1的冬凌草甲素處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，采用Western blot觀察凋亡相關(guān)蛋白PARP，Bcl-2，caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，冬凌草甲素處理乳腺癌細(xì)胞后可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)caspase-3及其底物PARP的切割（圖3）。

3 討論

ROS依據(jù)其分子類型的不同可分為非離子型和離子型，包括過(guò)氧化氫、羥自由基、超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧、烷過(guò)氧化自由基、脂過(guò)氧化自由基等。細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡對(duì)于細(xì)胞的存活及功能至關(guān)重要，低水平的ROS在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用[13]。研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)通常發(fā)生異常變化，引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高[14]。升高的ROS不僅使腫瘤細(xì)胞更易于發(fā)生基因突變，且使腫瘤細(xì)胞對(duì)異常升高的ROS較正常細(xì)胞更為敏感[15]。許多抗腫瘤化合物可通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[16-17]。通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族的磷酸化和泛素化，ROS可上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Hildeman等報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)ROS的升高可通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)引起線粒體膜電位的下降，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)以DCFH-DA為細(xì)胞內(nèi)ROS探針，檢測(cè)到冬凌草甲素可升高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示冬凌草甲素可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提示其可能通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)ROS而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。

細(xì)胞凋亡是受死亡信號(hào)調(diào)節(jié)并伴隨天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspases）活化的一種自主而有序的細(xì)胞死亡形式，是多基因嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程[20]。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，分為抗凋亡成員和促凋亡成員兩大類，前者包括Bcl-2，Bcl-XL，Mcl-1等，可保護(hù)線粒體膜的完整性；后者包括Bax，Bak，Bad等，可促使多種凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，通過(guò)激活caspases觸發(fā)細(xì)胞凋亡[21]。caspases蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，該分子被上游信號(hào)Bcl-2等激活后可引發(fā)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)切割其底物核蛋白PARP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22]。本實(shí)驗(yàn)中，冬凌草甲素處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并引發(fā)caspase-3和PARP的切割，提示冬凌草甲素可能通過(guò)提高線粒體膜的通透性、激活caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冬凌草甲素可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)并激活caspase-3相關(guān)，但ROS下調(diào)Bcl-2表達(dá)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ferlay J， Soerjomataram I， Dikshit R， et al. Cancer incidence and mortality worldwide： sources， methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer， 2015， 136（5）： E359.

[2] Rakha E A， Ellis I O. Triple-negative/basal-like breast cancer： review[J]. Pathology， 2009， 41（1）： 40.

[3] Stagg J， Allard B. Immunotherapeutic approaches in triple-negative breast cancer： latest research and clinical prospects[J]. Ther Adv Med Oncol， 2013， 5（3）： 169.

[4] Foulkes W D， Smith I E， Reis-Filho J S. Triple-negative breast cancer[J]. N Engl J Med， 2010， 363（20）： 1938.

[5] Wang S， Zhong Z， Wan J， et al. Oridonin induces apoptosis， inhibits migration and invasion on highly-metastatic human breast cancer cells[J]. Am J Chin Med， 2013， 41（1）： 177.

[6] Xiao X， He Z， Cao W， et al. Oridonin inhibits gefitinib-resistant lung cancer cells by suppressing EGFR/ERK/MMP-12 and CIP2A/Akt signaling pathways[J]. Int J Oncol， 2016， 48（6）： 2608.

[7] Liu Q Q， Chen K， Ye Q， et al. Oridonin inhibits pancreatic cancer cell migration and epithelial-mesenchymal transition by suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Cancer Cell Int， 2016， 16： 57.

[8] Ren C M， Li Y， Chen Q Z， et al. Oridonin inhibits the proliferation of human colon cancer cells by upregulating BMP7 to activate p38 MAPK [J]. Oncol Rep， 2016， 35（5）： 2691.

[9] Liu Z， Ouyang L， Peng H， et al. Oridonin： targeting programmed cell death pathways as an anti-tumour agent[J]. Cell Prolif， 2012， 45 （6）： 499.

[10] Li C Y， Wang E Q， Cheng Y， et al. Oridonin： an active diterpenoid targeting cell cycle arrest， apoptotic and autophagic pathways for cancer therapeutics [J]. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43 （5）： 701.

[11] Zou X， Liang J， Sun J， et al. Allicin sensitizes hepatocellular cancer cells to anti-tumor activity of 5-fluorouracil through ROS-mediated mitochondrial pathway [J]. J Pharmacol Sci， 2016， 131（4）： 233.

[12] Wang H， Zhang T， Sun W， et al. Erianin induces G₂/M-phase arrest， apoptosis， and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo[J]. Cell Death Dis， 2016， 7（6）： e2247.

[13] D′Autreaux B， Toledano M B. ROS as signalling molecules： mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2007， 8（10）： 813.

[14] Mondal A， Bennett L L. Resveratrol enhances the efficacy of sorafenib mediated apoptosis in human breast cancer MCF7 cells through ROS， cell cycle inhibition， caspase 3 and PARP cleavage[J]. Biomed Pharmacother， 2016， 84： 1906.

[15] Locasale J W， Vander Heiden M G， Cantley L C. Rewiring of glycolysis in cancer cell metabolism[J]. Cell Cycle， 2010， 9（21）： 4253.

[16] Zhong F， Tong Z T， Fan L L， et al. Guggulsterone-induced apoptosis in cholangiocarcinoma cells through ROS/JNK signaling pathway [J]. Am J Cancer Res， 2016， 6（2）： 226.

[17] Zhang M， Su L， Xiao Z， et al. Methyl jasmonate induces apoptosis and pro-apoptotic autophagy via the ROS pathway in human non-small cell lung cancer [J]. Am J Cancer Res， 2016， 6（2）： 187.

[18] Li D， Ueta E， Kimura T， et al. Reactive oxygen species （ROS） control the expression of Bcl-2 family proteins by regulating their phosphorylation and ubiquitination[J]. Cancer Sci， 2004， 95（8）： 644.

[19] Hildeman D A， Mitchell T， Aronow B， et al. Control of Bcl-2 expression by reactive oxygen species [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2003， 100（25）： 15035.

[20] Gillies L A， Kuwana T. Apoptosis regulation at the mitochondrial outer membrane[J]. J Cell Biochem， 2014， 115（4）： 632.

[21] Mohana-Kumaran N， Hill D S， Allen J D， et al. Targeting the intrinsic apoptosis pathway as a strategy for melanoma therapy [J]. Pigment Cell Melanoma Res， 2014， 27（4）： 525.

[22] Cullen S P， Martin S J. Caspase activation pathways： some recent progress[J]. Cell Death Differ， 2009， 16（7）： 935.

[責(zé)任編輯 張寧寧]