陳慧芹 王小平 羅樹紅 王麗潔 陳倩倩 郝文波

（南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院抗體工程研究所，廣州 510515）

羊口瘡病毒蛋白ORFV035的表達、純化和多克隆抗體的制備

陳慧芹 王小平 羅樹紅 王麗潔 陳倩倩 郝文波

（南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院抗體工程研究所，廣州 510515）

克隆表達羊口瘡病毒蛋白ORFV035，并制備其多克隆抗體，為后續(xù)對病毒復制、裝配、形態(tài)發(fā)生和成熟過程的研究奠定基礎。PCR擴增羊口瘡病毒ORFV035基因，將其與質粒pET-30a（+）經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后連接，構建重組質粒pET30a-035。重組質粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定，轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達，SDS-PAGE鑒定蛋白表達情況。表達產物進行超聲破碎和Ni柱純化，純化后目的蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體并對其進行鑒定。成功構建了重組質粒pET30a-035，在大腸桿菌BL21中以包涵體形式高效表達。包涵體洗滌、溶解后進行Ni柱純化，得到純度較高的ORFV035-his融合蛋白。以純化蛋白免疫小鼠獲得多克隆抗體。Western blot檢測顯示該多抗可以識別天然ORFV035蛋白。成功誘導表達、純化ORFV035蛋白并制備ORFV035多克隆抗體。

羊口瘡病毒；ORFV035；純化；多克隆抗體

羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）屬痘病毒科，副痘病毒屬。該病毒可引起羊傳染性膿皰病，是羊的主要疫病之一［2］。由于病毒的抵抗力強，羊群一旦被感染則不易清除，可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失。ORFV基因組含132個基因，由末端基因區(qū)和中間核心基因區(qū)組成［4］。ORFV中間核心基因區(qū)（ORFs009-111）較保守，主要包括與病毒復制和病毒粒子裝配成熟的相關基因，與痘病毒相關基因的同源性較高［5］。ORFV035即為中間核心區(qū)的一個基因，較保守，基因全長為1 293 bp，編碼大小約48.68 kD的蛋白。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，ORFV035基因與痘苗病毒（VV）I7L的基因結構類似。在痘苗病毒中，I7L編碼核心半胱氨酸蛋白水解酶，主要識別核心蛋白前體P25K和P4b的A-G-A位點，是核心蛋白的成熟，病毒組成和感染子代所必須的。羊口瘡病毒的ORFV035是否同樣編碼半胱氨酸蛋白水解酶，發(fā)揮與痘苗病毒I7L基因類似的功能，尚有待進一步研究［6］。

本研究通過PCR擴增獲取了ORFV035的基因片段，將其克隆入pET-30a（+）中。經(jīng)誘導表達獲得與His融合表達的ORFV035蛋白，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，旨為進一步研究035蛋白在ORFV感染過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質粒及菌株 ORFV NA1/11病毒株及其基因組DNA和質粒pET-30a（+）由本室保存；TOP10感受態(tài)細胞和大腸桿菌BL21（DE3）pLys購自TIANGEN公司。

1.1.2 試劑 PrimeStar Max DNA聚合酶、限制性核酸內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、DNA Marker、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段凝膠純化回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega公司；LB培養(yǎng)基，酶切緩沖液10× K buffer，TAE緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司；SDS-PAGE電泳緩沖液，SDS樣品緩沖液，考馬斯亮藍R-250染色液，考馬斯亮藍脫色液，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計 利用Primer 5.0軟件設計擴增ORFV035基因的特異性引物，在上、下游引物中分別引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。引物序列如下：Forward primer：（BamH Ⅰ）5'GCGGATCCATG GACAAGTACACGGATTTAGTGG 3'；Reverse primer：（Hind Ⅲ）5' ATAAGCTTTTCATGGCGCCGCCGGCTT CTCGGG 3'。引物送華大基因公司合成。

1.2.2 PCR擴增 以ORFV NA1/11基因組為模板，建立 50 μL PCR 反應體系：PrimeStar Mix 25 μL、病毒 DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 21 μL、DMSO 1 μL。反應條件：98℃預變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸15 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠回收擴增產物。

1.2.3 重組質粒的構建與鑒定 將回收的PCR產物與質粒pET-30a（+）分別進行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，膠回收后用T4 DNA連接酶4℃反應過夜，連接產物轉化TOP10感受態(tài)細胞?？敲顾睾Y選陽性重組克隆，提取質粒進行雙酶切鑒定，并送華大基因有限公司進行DNA測序。

1.2.4 重組質粒的誘導表達和SDS-PAGE分析 測序正確的重組質粒pET30a-035及空質粒pET-30a（+）分別轉化大腸桿菌BL21。分別挑單個菌落接種于1 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)2 h；按1∶1 000的比例將菌液加到對應的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD≈0.6；收集未誘導的菌液作為陰性對照，余下菌液按1∶500加誘導劑IPTG使終濃度為0.2 mmol/L，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。10% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。相同條件對小量表達成功的陽性重組菌進行大量表達，收集誘導后樣品。冰浴中超聲破碎菌體。裂解后的菌液分別收集超聲上清和沉淀，10% SDS-PAGE分析重組蛋白的可溶性。

1.2.5 包涵體溶解 大量誘導表達的菌體，用1× PBS重懸，并加入溶菌酶，-80℃反復凍融3次。1∶ 1 000加入100 mmol/L PMSF，冰上超聲破碎菌體，4℃高速離心收集包涵體沉淀。用包涵體洗滌液重懸沉淀，攪拌2 h，12 000 r/min，4℃條件下離心30 min，棄上清繼續(xù)重懸沉淀，共洗滌包涵體3次。用40 mL×2的1% NLS（十二烷基肌氨酸鈉）徹底重懸沉淀［7］，4℃震蕩3 d，12 000 r/min，4℃，60 min離心收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析鑒定。

1.2.6 Ni柱親和層析純化 采用鎳柱親和層析法純化包涵體蛋白［8］。將1% NLS溶解的融合蛋白用0.22 μmol/L濾膜過濾，過平衡好的鎳柱，再用含1% NLS的Binding Buffer平衡，采用0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L咪唑的Elution Buffer進行洗脫，并分別收集流穿液和洗脫液［9］。10% SDS-PAGE電泳分析蛋白純化情況［10］。

1.2.7 ORFV035抗血清的制備及鑒定 純化的pET30a-035融合蛋白與弗氏佐劑以1∶1（V/V）的比例進行乳化后對小鼠的頸部、背部皮下多點注射。首次免疫采用弗氏完全佐劑，抗原劑量為80 μg/只；之后每隔1周，加強免疫一次，抗原劑量不變，佐劑為弗氏不完全佐劑，加強免疫3次。第3次免疫后3 d斷尾采集少量血，分離血清測定效價。待效價符合要求后，再加強免疫一次，3 d后眼球采血，靜置后4℃離心后取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。Western blot分析制備的ORFV035抗血清的特異性。用感染復數(shù)（MOI）為3的野生株病毒感染OFTu細胞，未感染病毒的細胞作為陰性對照，感染后24 h裂解細胞，加入含β-巰基乙醇的2× loading buffer煮樣，離心后取上清進行SDS-PAGE電泳，用全濕法電轉移到0.22 μmol/L PVDF膜。以制備的ORFV035多抗為一抗（1∶2 000），HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光顯影。

2 結果

2.1 PCR擴增ORFV035基因

PCR擴增ORFV035基因，擴增產物經(jīng)瓊脂凝膠電泳鑒定，獲得了與預期大?。? 293 bp）相符的特異性片段，見圖1。

圖1 ORFV035基因片段PCR擴增結果

2.2 重組質粒pET30a-035的構建與鑒定

PCR產物回收后與質粒pET30a（+）雙酶切、連接和轉化，成功構建了重組質粒pET30a-035。重組質粒pET30a-035用BamH I和Hind III進行雙酶切鑒定，除載體片段外，還出現(xiàn)了約1 293 bp的條帶，其大小與預期相符（圖2）。選取陽性克隆送華大基因有限公司進行DNA測序，結果與NA1/11株ORFV035基因完全一致。

圖2 重組質粒ORFV-035的雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達與鑒定

重組質粒pET30a-035在大腸桿菌BL21中小量誘導表達，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，與對應空載體pET-30a的菌液相比，重組質粒pET30a-035的誘導菌在大小40-55 kD間出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶。而未誘導的重組質粒轉化菌和空載體質粒轉化菌均沒有出現(xiàn)相同的條帶（圖3）。擴大培養(yǎng)后，收集細菌，經(jīng)超聲破碎及離心分離沉淀和上清，分別進行SDS-PAGE電泳，結果（圖4）顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，表明蛋白表達產物主要以包涵體形式存在。

圖3 SDS-PAGE分析pET30a-035的誘導表達

圖4 SDS-PAGE分析pET30a-035融合蛋白的可溶性

2.4 包涵體的溶解與純化

將洗滌過的包涵體用1% NLS溶解，離心后收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，結果（圖5）顯示重組蛋白主要存在于上清中，表明重組表達的包涵體蛋白溶解效果較佳。

圖5 pET30a-035 1% NLS溶解效果的檢測

溶解后的包涵體蛋白過鎳柱親和純化，SDSPAGE電泳結果（圖6）顯示，洗脫獲得的目的蛋白相比誘導表達的重組蛋白和流穿液中的目的蛋白雜帶明顯減少，達到預期純化效果。

2.5 多克隆抗體的制備與鑒定

以純化的重組ORFV035免疫小鼠，制備了鼠抗ORFV035多克隆抗血清。效價測定顯示該多抗血清效價達1∶20 000以上。Western blot分析（圖7）顯示ORFV多抗能識別病毒感染OFTu細胞組約48 kD的特異性條帶，而正常OFTu細胞組未見到此大小條帶，表明該多抗能夠識別天然ORFV035蛋白，可用于后期該蛋白的功能研究。

圖6 pET30a-035純化效果SDS-PAGE檢測

圖7 Western blot檢測天然ORFV035蛋白

3 討論

羊口瘡病毒的ORFV035與痘苗病毒的I7L同源性高。在早期和晚期的病毒裝配中，I7L編碼的病毒蛋白酶與病毒包膜和核心蛋白在特異性位點AG/X斷裂相關［11］，也參與到了體內三大核心蛋白的水解（P4a、P4b和P25K）［12］?？梢哉f，I7L編碼的半胱氨酸蛋白酶和其他基因產物負責病毒核心蛋白水解酶（vCPP）的活動［13］。ORFV035預測功能與I7L相似，推斷在ORFV病毒裝配中也是需要其作為核心蛋白水解酶來水解核心蛋白以達到形成有感染性子代的目的。研究該蛋白質水解反應的酶學和輔助因子的需求，有可能促進抗病毒藥物的發(fā)展［14］。而對ORFV035的結構和功能的進一步研究都需要有效表達該蛋白并制備其特異性抗體。

本實驗中，為獲得滿足免疫原用量需求的ORFV035蛋白大量表達，選用大腸桿菌作為表達體系。因為缺乏真核蛋白修飾體系，二硫鍵的錯配加大了蛋白發(fā)生錯誤折疊的可能性，表達產物主要為包涵體形式。實驗中嘗試了多種誘導條件，包括18℃的低溫表達等，結果依然為包涵體表達。而配對正確的二硫鍵是形成正確蛋白構象的前提，所以要想獲得具有生物活性的蛋白必須經(jīng)過包涵體的變性和復性，打斷錯配的二硫鍵并重新配對。我們對包涵體蛋白的溶解條件也做了多次摸索，采用常規(guī)的尿素溶解方法，濃度達到8 mol/L尿素溶解效果仍不佳。后采用1% NLS（十二烷基肌氨酸鈉），終于獲得較好包涵體蛋白溶解效果。包涵體溶解后純化的蛋白作為免疫原免疫小鼠，也獲得了效價好、能特異性識別天然ORFV035的多克隆抗血清。

4 結論

本研究成功構建了原核表達質粒pET30a-035，并在大腸桿菌BL21中以包涵體形式高效表達。包涵體經(jīng)變性、復性、純化后獲得的ORFV035融合蛋白具有較好的免疫原性，免疫小鼠獲得了效價好、能特異性識別天然ORFV035的多克隆抗體。

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（責任編輯 狄艷紅）

Expression and Purification of orf Virus Protein ORFV035 and Preparation of Polyclonal Antibody

CHEN Hui-qin WANG Xiao-ping LUO Shu-hong WANG Li-jie CHEN Qian-qian HAO Wen-bo
（Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou 510515）

This work aims to express and purify recombinant orf virus encoded protein 035（ORFV035）in Escherichia coli and prepare a polyclonal antibody（pAb）against ORFV035 for immunoassays，as well as lay foundation for the further researches on the replication，assembly，morphogenesis，and mature process . The gene of ORFV035 was amplified by PCR from orf viral genome，and sub-cloned into the expression vector pET-30a（+），and recombinant plasmid pET-30a-035 was constructed by enzymatic digestion and ligation of BamH I and Hind III. Then the plasmid pET-30a-035 after double enzyme digestion and sequencing was transformed into Escherichia coli BL21，the transformants were induced by IPTG，and SDS-PAGE was used to identify the expression of the protein. The His-tagged fusion protein ORFV035 was ultrasonic-treated and then purified through Ni-chelating affinity chromatography. The purified ORFV035 was used to immune into BALB/c mouse for producing anti-ORFV035 pAb. The results showed that the recombinant plasmids pET30a-035 was successfully constructed，and the protein ORFV035 in E. coli BL21 was in inclusion body. The ORFV035-his fusion protein was obtained after washing，dissolving，and purifying the inclusion body，and the pAb anti-ORFV035 was prepared. The Western blot analysis showed that this pAb recognized natural ORFV035.

orf virus；ORFV035；purification；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1182

2017-01-01

國家自然科學基金項目（31672536，31170147）

陳慧芹，女，碩士，研究方向：羊口瘡病毒ORFV119蛋白誘導細胞凋亡的分子機制；E-mail：595235420@qq.com

郝文波，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：病原體與宿主相互作用；E-mail：haowa@126.com