梁昌盛，李佳，陳晗，張麗芝，張杰濱，馮一葦

（中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，廣東 廣州 510080）

蜂膠在免疫實驗教學(xué)中應(yīng)用的實驗研究

梁昌盛，李佳，陳晗，張麗芝，張杰濱，馮一葦

（中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，廣東 廣州 510080）

目的 為提高免疫實驗教學(xué)質(zhì)量，尋找一種安全、高效的免疫佐劑。方法選取牛血清白蛋白為抗原，制備弗氏佐劑-抗原乳化物和蜂膠-抗原混合物，分別免疫昆明種小鼠后，取小鼠血清，通過SDS-PAGE檢測血清中IgG的產(chǎn)生情況，經(jīng)間接ELISA法分析小鼠抗血清效價，觀察兩種不同佐劑對誘導(dǎo)小鼠獲得性免疫應(yīng)答作用的差異。結(jié)果 蜂膠佐劑比弗氏佐劑免疫小鼠血清中IgG的產(chǎn)生時間更快、效價更高、更持久。結(jié)論 蜂膠佐劑在免疫學(xué)教學(xué)實驗中的應(yīng)用切實可行，有利于提高免疫實驗教學(xué)質(zhì)量。

蜂膠；免疫學(xué)；實驗研究；教學(xué)

在我校免疫學(xué)實驗教學(xué)過程中，一直使用弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）作為免疫佐劑來觀測小鼠的免疫應(yīng)答。此方法作為教學(xué)實驗應(yīng)用存在以下不足：CFA因含有卡介苗和礦物油等毒性物質(zhì)，會造成動物機體局部結(jié)節(jié)和無菌性膿腫，引起傷口潰爛，嚴(yán)重可以導(dǎo)致動物死亡，從而造成學(xué)生實驗無法連續(xù)；有研究［1］表明CFA可能有致癌作用，并且因其為粘稠的油性佐劑，在注射免疫動物時比較費力，經(jīng)常有學(xué)生在免疫動物的時候會不小心扎到自己或同學(xué)的手部，從而導(dǎo)致手部發(fā)炎。為提高免疫實驗教學(xué)質(zhì)量，尋找一種安全、高效的免疫佐劑很有必要。

蜂膠是蜜蜂從植物中采集的樹脂、花粉及蜂蠟等多種物質(zhì)的混合物。有研究［2］表明蜂膠具有天然的免疫功能，本身無抗原性和過敏性，將蜂膠作為免疫佐劑，既可保持抗原特性，又可成為良好的免疫增強劑和促進劑，有促進抗體產(chǎn)生的功能。

本實驗通過以牛血清白蛋白（BSA）為抗原，觀察CFA和蜂膠兩種不同佐劑對誘導(dǎo)小鼠獲得性免疫應(yīng)答作用的差異，探討蜂膠在免疫學(xué)教學(xué)實驗中的應(yīng)用價值，為其在免疫學(xué)教學(xué)實驗中的應(yīng)用可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物6周齡SPF級昆明種小鼠，體重18～22 g，雌性，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。

1．2 試劑及設(shè)備水溶性純蜂膠，純度＞90%，為杰禾蜂業(yè)有限公司產(chǎn)品；CFA，由本實驗室制備；0．01M PBS，無菌超凈水，PBS－T等。冷凍離心機（Sigma），洗板機（Biotek ELX50），酶標(biāo)儀（TECAN Sunrise）。

1．3 免疫抗原的制備快速稱取一定量的水溶性純蜂膠，溶于無菌超凈水中，制成40 mg／mL的蜂膠佐劑。取40 mg／mL的蜂膠0．5 mL加2 mg／mL牛血清白蛋白（BSA）0．5 mL，充分混勻，制備成蜂膠－BSA混合物。將液體石臘油和無水羊毛脂按3∶1比例制成不完全弗氏佐劑，在此基礎(chǔ)上加入滅活的卡介苗（終濃度為5 mg／mL）即為完全弗氏佐劑（CFA）。取CFA 0．5 mL加2 mg／mL牛血清白蛋白（BSA）0．5 mL，用電動攪拌法乳化，制備成CFA－BSA乳化物。

1．4 動物分組及免疫注射將昆明小鼠分成正常對照組、蜂膠－BSA組、CFA－BSA組三組，每組20只。蜂膠－BSA組、CFABSA組分別皮下注射蜂膠－BSA和CFA－BSA 0．1 mL，使兩組的BSA注射量均為100 μg［3］。正常對照組皮下注射生理鹽水0．1 mL。并于第7天及第14天進行加強免疫。注射后7、14、21、28天，各組分別眼球采血處死小鼠5只進行試驗。

1．5 檢測指標(biāo)

1．5．1 ELISA法分析小鼠抗血清效價使用標(biāo)準(zhǔn)96孔酶標(biāo)板，BSA 1 μg／孔進行包被。封閉后加入1∶100稀釋的小鼠血清100 μL，免疫后7天小鼠血清對倍稀釋到第十孔，其余時間的小鼠血清對倍稀釋到第二十孔，并做陽性、陰性血清對照。置37℃孵育1 h。經(jīng)徹底洗滌后，加辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)羊抗小鼠IgG（1∶1 000稀釋）100 μL。37℃孵育45 min。最后加100 μL底物TMB，避光室溫孵育至陽性孔顯色，加入終止液2 mol／L H2SO4終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值。

1．5．2 SDS-PAGE檢測血清中IgG免疫后7天、14天取小鼠血清分別作25倍稀釋后，以還原型處理液處理，上樣量20 μL。按照Laemmli體系，濃縮膠5%，分離膠12%，電壓120 V，時間2 h，硝酸銀染色。

2 結(jié)果

2．1 ELISA法檢測小鼠抗血清效價結(jié)果小鼠血清效價的確定，根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中，《實驗動物－酶聯(lián)免疫吸附試驗》要求判定陰性和陽性血清，以陽性血清A490大于陰性對照平均值2．1倍時的最低稀釋度為ELISA效價。實驗統(tǒng)計結(jié)果顯示，蜂膠－BSA組各時間點的小鼠抗血清效價均高于CFABSA組；蜂膠－BSA組免疫后7天抗血清效價為1∶6 400，比CFA－BSA組免疫后7天抗血清效價1∶1 600高4倍，表明蜂膠－BSA組產(chǎn)生IgG的量更多；見表1。

表1 小鼠免疫血清抗體效價結(jié)果（n＝5，±s）

表1 小鼠免疫血清抗體效價結(jié)果（n＝5，±s）

組別蜂膠-BSA組CFA-BSA組P 7天1∶（6400±3200）1∶（1600±800）＜0．05 14天1∶（409600±204800）1∶（102400±51200）＜0．05 21天1∶（1638400±81920）1∶（819200±409600）＜0．05 28天1∶（819200±409600）1∶（204800±102400）＜0．05

2．2 SDS-PAGE檢測血清中IgG結(jié)果IgG（150 kDa）經(jīng)巰基乙醇分解后產(chǎn)生重鏈（50 kDa）和輕鏈（25 kDa），如圖1所示。正常對照組血清（5條帶）在50 kDa和25 kDa處沒有出現(xiàn)明顯的條帶；而免疫后7天、14天的小鼠血清均出現(xiàn)明顯的條帶，說明蜂膠－BSA、CFA－BSA兩組小鼠免疫后7天血清中均產(chǎn)生一定量的IgG，且蜂膠－BSA組小鼠免疫后7天血清中的IgG含量高于CFA－BSA組，這與ELISA法檢測小鼠抗血清效價結(jié)果相符。

3 討論

國外著名科學(xué)家杜尼耶文通過實驗證明：蜂膠能增加白細(xì)胞的吞噬活性，使機體血清總蛋白和球蛋白合成量增加，并使免疫出現(xiàn)早且持續(xù)時間長［4］；柴家前等［5］證實，將蜂膠配合抗原引入機體，能增加抗體產(chǎn)生，還能對胸腺、脾臟及整個免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響，引起強烈的漿細(xì)胞反應(yīng)并刺激局部和遠(yuǎn)區(qū)淋巴結(jié)的抗體產(chǎn)生，并可通過激活巨噬細(xì)胞而增強免疫應(yīng)答，顯著增強機體免疫功能。本實驗中，ELISA法檢測小鼠抗血清效價結(jié)果表明，將蜂膠配合抗原引入機體，能產(chǎn)生大量的抗體，蜂膠－BSA組免疫后7、28天的抗血清效價比CFA－BSA組高4倍，且ELISA、SDS－PAGE檢驗結(jié)果相互一致，和上述文獻中的實驗結(jié)果相符，蜂膠能使免疫出現(xiàn)早且持續(xù)時間長。

圖1 小鼠血清SDS-PAGE銀鹽染色結(jié)果

蜂膠作為免疫佐劑已廣泛用于制造多種獸用疫苗，并因其不影響抗原的抗原性，保護率高，接種后無不良反應(yīng)，其中禽霍亂蜂膠疫苗在我國已試用推廣到全國30多個省市區(qū)［6－7］?，F(xiàn)在國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)學(xué)院校在免疫學(xué)實驗教學(xué)過程中，都會使用CFA作為免疫佐劑來觀測小鼠的免疫應(yīng)答，未見蜂膠作為免疫佐劑在免疫學(xué)實驗教學(xué)應(yīng)用的有關(guān)文獻報道。本實驗結(jié)果表明，蜂膠配合抗原注入小鼠體內(nèi)，注射部位無腫脹、無壞死、無膿腫，機體能快速產(chǎn)生抗體。蜂膠溶液是水性溶液，和抗原只要簡單混合均勻，不要特殊方法處理，并且注射方便。與傳統(tǒng)CFA油性佐劑相比更安全、抗體效價更高、更持久，并且資源豐富、價格低廉。因此，蜂膠佐劑在免疫學(xué)教學(xué)實驗中的應(yīng)用切實可行，有利于提高免疫實驗教學(xué)質(zhì)量，值得推廣。

[1]李淵,孫紅祥．不同類型免疫佐劑的作用比較[J]．浙江畜牧獸醫(yī), 2003,28(5)：16-18．

[2]劉杉,劉云志,楊金生,等．免疫佐劑的研究進展[J]．吉林畜牧獸醫(yī),2011,32(8)：46-47．

[3]周俊宜．分子醫(yī)學(xué)技能[M]．北京：科學(xué)出版社,2006：232-233．

[4]裴志花,王開．蜂膠佐劑在畜禽疫苗中的應(yīng)用[J]．吉林畜牧獸醫(yī), 2007,28(1)：21-22．

[5]柴家前,王玲,龐昕,等．納米蜂膠顆粒對雞免疫功能的影響[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2002,33(4)：412-416．

[6]向會耀,譚玉梅,向雅倩,等．蜂膠佐劑對E.coli多價滅活苗免疫小鼠效果的實驗研究[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(5)：535-536．

[7]高澤乾,孫建男,武煒,等．獸用免疫佐劑的研究進展[J]．唐山師范學(xué)院學(xué)報,2012,34(2)：45-48．

（責(zé)任編輯：常海慶）

Experimental Study on the Application of Propolis in the Experiment Teaching of Immunology

LIANG Changsheng,LI Jia,CHEN Han,ZHANG Lizhi,ZHANG Jiebin,FENG Yiwei
(Experimental Center for Basic Medical Teaching,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)

ObjectiveTo find a safe and effective immune adjuvant in order to improve the teaching quality of immune experiment.MethodsUsing bovine serum albumin as antigen,complete Freund's adjuvant-antigen emulsification and propolis-antigen mixture were prepared to immunize Kunming mice.Later,the serum of mice were collected to detect the production of IgG by SDS-PAGE,and analyze theserumantibodytiterofmice.Thedifferencebetweentwokindsofadjuvantintheeffectininducingimmuneresponseofmicewereobserved.ResultsThe propolis adjuvant had faster production time,higher titer and longer duration than Freund's adjuvant.ConclusionsThe propolis adjuvant is feasible applied in immune experiment in teaching,and helpful to improve the teaching quality of immune experiment.

Propolis;Immunology;Experimental study;Teaching

R392-33

A

10．3969/j．issn．1674-4659．2017．06．0765

2017－01－17

2017－04－07

中山大學(xué)實驗室開放基金項目（項目編號：KF201242）

梁昌盛（1976－），男，廣東肇慶人，大學(xué)本科學(xué)歷，從事醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)研究和管理工作，E－mail：lchangsh＠m(xù)ail．sysu．edu．cn。