劉朝圣，龔 堅，申夢潔

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410007；2.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

湘西龍山百合對小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影響

劉朝圣1,2，龔 堅3，申夢潔3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410007；2.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的觀察不同濃度湘西龍山百合提取液對小鼠B-16細(xì)胞細(xì)胞活力、黑色素含量、酪氨酸酶活性的影響。方法選用同一傳代小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞并分組，分別加入不同濃度百合提取液、維生素C二種溶液作用3 d后，用MTT法測定B-16細(xì)胞活力；用Maeda等的方法測定B-16細(xì)胞酪氨酸酶活性；用Victoria等的方法測定B-16細(xì)胞黑色素含量。結(jié)果湘西龍山百合提取液對小鼠B-16細(xì)胞的酪氨酸酶活性、黑色素合成的抑制作用明顯強(qiáng)于維生素C，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且其抑制作用隨濃度的增加而增加；同時湘西龍山百合提取液其細(xì)胞毒性作用同樣強(qiáng)于維生素C，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論百合提取液對B-16細(xì)胞的生長、酪氨酸酶活性和黑色素合成的抑制作用強(qiáng)于維生素C，其抑制作用與濃度呈正相關(guān)。

湘西龍山百合；維生素C；B-16細(xì)胞；黑色素；酪氨酸酶

隨著人們生活水平和審美標(biāo)準(zhǔn)的提高，越來越多的人追求皮膚的白皙與潤澤。近年來，美白化妝品順應(yīng)“回歸自然”的潮流，紛紛選用自然界綠色、無毒、有效的物質(zhì)為原料，以滿足消費(fèi)者的需求。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為百合味甘微苦，性微寒，入肺、胃、心經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效[1]；現(xiàn)代分析表明，百合主要含皂苷類、多糖類、磷脂類、生物堿類等活性成分，還含有淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、各種維生素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，有較高的臨床應(yīng)用價值。從外觀而言，新鮮百合本身色白晶瑩，按照中醫(yī)皮膚“以色治色”理論，其在美白領(lǐng)域應(yīng)有較大應(yīng)用前景。湖南湘西龍山百合是全國知名的道地藥材，在前期臨床觀察基礎(chǔ)上，本研究探討湘西龍山百合對小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞株酪氨酸酶活性和黑色素含量的影響，為百合在美白領(lǐng)域應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 受試物

百合原材料為湖南新世紀(jì)集團(tuán)提供的卷丹百合Lilium lancifolium（龍山百合）的干燥肉質(zhì)鱗葉；維生素C（Vit C，規(guī)格 2 mL:0.1 g）：石藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司，批號H13022052。

1.2 試劑

2,6-二氯酚靛酚（2，6-D），北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品，批號：D8410；小牛血清，美國Hy-Clone公司產(chǎn)品，批號：NWK0489；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國HyClone公司產(chǎn)品，批號：NAC1362；左旋多巴(L-dopa)，南京奧多福尼生物科技有限公司產(chǎn)品，批號：A0169；噻唑藍(lán)(MTT)，中國Solarbio公司產(chǎn)品，批號：M8180；二甲基亞砜(DMSO)，中國 Solarbio 公司產(chǎn)品，批號：M0231；2.5 g/L胰酶，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品，批號：T1300；pH 6.8磷酸緩沖液（PBS），北京中彬金橋公司產(chǎn)品，批號：ZLI-9062；Triton X-100，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品，T8200；無水乙醇、2-丙二醇，均為國藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.3 儀器

DNP-9162 CO2孵箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；752-P酶聯(lián)免疫檢測儀，上?，F(xiàn)科儀器有限公司生產(chǎn)；TG-16M低溫冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞購自湖南省湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液傳代，置于CO2培養(yǎng)箱37℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。每一次實驗取自同一傳代細(xì)胞，初始接種細(xì)胞濃度為5 000個/cm2左右。

2.2 藥品制備

2.2.1 百合提取物的配制 參照張秀芳、賀文英等報道的方法[3]提取百合提取液：將龍山百合粉碎，用無水乙醇浸泡、振蕩或攪拌，浸泡24 h以上，24 h后濾過，收集浸取液；剩余的藥渣再加無水乙醇溶液浸取24 h以上。將兩次浸取液的濾液，回收乙醇，最后得到百合提取物(濃度為45.5 g/mL)。

2.2.2 百合提取物中Vit C含量的測定 采用2，6-D滴定法進(jìn)行測定[4]。將一定量的百合提取液溶于草酸中，用相應(yīng)濃度的2，6-D溶液去緩慢滴定混合液，當(dāng)混合液開始出現(xiàn)淡紅色時，停止滴定，從2，6-D消耗量計算出被檢樣品中Vit C的量。

2.2.3 不同濃度百合提取液及Vit C溶液的配制（1）配制溶媒：先配制PEH溶液（按雙蒸水∶無水乙醇∶2-丙二醇=2∶3∶5 的比例配制）， 后用 0.01 mol/L的PBS液將PEH溶液釋成100 mL/L溶液作為溶媒；（2）用溶媒將百合提取物和Vit C配成10 g/L的濃度，再把10 g/L維生素C溶液稀釋成0.01、0.02、0.04、0.08 g/L 的濃度備用[5]；根據(jù)所測定的百合提取液中Vit C含量按比例稀釋成4組濃度的百合溶液，使其中所含Vit C的量分別與4組濃度的Vit C溶液接近。

2.3 MTT法測定B-16黑色素瘤細(xì)胞活力抑制率

取第3代小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞以6×104個/mL的密度接種于96孔板中,每孔100 μL。37℃CO2孵箱中培養(yǎng)1 d后，吸棄上清液，實驗組（百合組、Vit C組）每孔加入DMEM高糖培養(yǎng)液180 μL及百合溶液或Vit C溶液20 μL，每一濃度4個孔；空白對照組每孔加入180 μL DMEM高糖培養(yǎng)液和20 μL溶媒溶液；空白孔不接種細(xì)胞。37℃ CO2孵箱中孵育3 d。藥物作用3 d后，每孔加入0.5%MTT 20 μL，繼續(xù)孵育 4 h，棄去上清液，每孔加入180 μL DMSO，振蕩 10 min，選擇 490 nm 波長以空白孔調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光度值。每一實驗重復(fù)4次，細(xì)胞活力抑制率=(1-實驗組各濃度平均吸光度值÷空白對照組各濃度平均吸光度值)×100﹪。

2.4 酪氨酸酶活性抑制率的測定

以L-Dopa為底物，參考Maeda等[6]的方法測定細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制率。各組及加藥情況同上，藥物作用3 d后，棄去上清液，0.01 mol/L的PBS洗2次，每孔加90 μL 10 mL/L的 Triton X-100，震蕩5 min以溶解細(xì)胞，每孔加10 μL 10 g/L的L-Dopa，37℃孵育30 min，于490 nm波長處，以空白孔調(diào)零，測各孔吸光度值。每一實驗重復(fù)4次，酪氨酸酶活性抑制率=(1-實驗組各濃度平均吸光度值÷對照組各濃度平均吸光度值)×100﹪。

2.5 黑色素合成抑制率的測定[7]

將培養(yǎng)的第3代黑色素細(xì)胞以1×104個/cm2密度接種于5個6孔板，24 h后換液，實驗組（百合組、維生素C組）每孔加入4.5 mL DMEM高糖培養(yǎng)液及0.5 mL百合溶液或Vit C溶液，空白對照組每孔加入4.5 mL DMEM高糖培養(yǎng)液和0.5 mL溶媒溶液；空白孔不接種細(xì)胞。每一濃度3個孔。37℃50 mL/L CO2孵箱孵育3 d后，棄去上清液，每孔加入2.5 g/L胰酶1 mL于室溫下消化2 min，加入4 mL DMEM高糖培養(yǎng)液中止消化，吹打成單細(xì)胞懸液.取0.5 mL作細(xì)胞計數(shù)，其余細(xì)胞懸液1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 1 mol/L 的NaOH，振蕩5 min.選擇490 nm 波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測吸光度值。每一實驗重復(fù)4次，黑色素合成抑制率=[1-(實驗孔吸光度值÷實驗孔細(xì)胞密度)÷(空白組對照孔吸光度值÷空白組對照孔細(xì)胞密度)]×l00﹪。

2.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布時,采用參數(shù)檢驗，方差齊時組內(nèi)采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Newmankeuls法檢驗，方差不齊者用Tambane’s T2檢驗；不符合正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗，等級資料多樣本比較采用Kruskal-wallis H秩和檢驗。所有結(jié)果以“±s”表示。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度百合提取液與Vit C對小鼠B-16細(xì)胞活力抑制率的影響

表1顯示，百合提取液及Vit C對小鼠B-16細(xì)胞活性均有抑制作用，其抑制作用均隨著濃度的增高而增高；但同一濃度，Vit C組對小鼠B-16細(xì)胞活力影響較小，尤其是Vit C濃度為0.01 g/L時，對小鼠B-16細(xì)胞活力影響最弱；而濃度為0.08 g/L的百合提取液對小鼠B-16細(xì)胞活力抑制作用最強(qiáng)。說明百合提取液對小鼠B-16細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用；百合液組及Vit C組組內(nèi)各濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同濃度百合組與Vit C組兩兩對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞活力抑制率的影響（±s，%）

表1 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞活力抑制率的影響（±s，%）

注：與 Vit C組相比 *P＜0.05。

組別百合液組Vit C組n 16 16 F P 0.08 g/L 50.42±0.66*37.46±0.44 1 921.036 0.000 0.04 g/L 41.53±0.72*30.12±0.67 1 011.523 0.000 0.02 g/L 36.84±0.56*24.31±0.66 1138.226 0.000 0.01 g/L 29.14±0.57*19.68±0.49 1826.620 0.000

3.2 不同濃度百合提取液與Vit C對小鼠B-16細(xì)胞酪氨酸酶抑制率的影響

表2顯示，百合提取液及Vit C對小鼠B-16細(xì)胞酪氨酸酶活性均有抑制作用，其抑制作用均隨著濃度的增高而增高；在同等濃度下，百合提取液對酪氨酸酶抑制作用明顯強(qiáng)于Vit C組。百合組及Vit C組組內(nèi)各濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.000＜0.01），兩組同濃度組間兩兩對比P＜0.05。

表2 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制率的影響（±s，%）

表2 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞酪氨酸酶活性抑制率的影響（±s，%）

注：與Vit C組相比*P＜0.05。

組別百合液組Vit C組n 16 16 FP 0.08 g/L 56.37±0.67*44.95±0.93 399.215 0.000 0.04 g/L 50.01±0.68*37.55±0.63 720.809 0.000 0.02 g/L 44.84±0.79*30.92±1.07 437.563 0.000 0.01 g/L 39.01±0.94*23.32±0.81 636.972 0.000

3.3 不同濃度百合提取液與Vit C對小鼠B-16細(xì)胞黑色素合成抑制率的影響

如表3可知，百合提取液和Vit C液隨濃度的增加對細(xì)胞黑色素的合成的抑制率增加；百合提取液對細(xì)胞黑色素合成的抑制率在各濃度都顯著高于Vit C液。百合液組及Vit C組組內(nèi)各濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），同濃度百合組及Vit C組組間兩兩對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞黑色素合成抑制率的影響（±s，%）

表3 不同濃度百合提取液、Vit C對小鼠B-16細(xì)胞黑色素合成抑制率的影響（±s，%）

注：與Vit C組相比*P＜0.05。

組別百合液組Vit C組n 12 12 FP 0.08 g/L 48.09±1.67*36.07±1.43 58.954 0.000 0.04 g/L 37.84±0.72*26.98±0.33 369.053 0.000 0.02 g/L 33.41±0.33*21.43±0.62 719.843 0.000 0.01 g/L 28.65±1.75*15.61±1.87 51.596 0.000

4 討論

現(xiàn)代研究表明，阻斷或抑制新的黑色素形成，還原或加速已有黑色素分解是美白主要機(jī)制。而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣血阻滯、肝氣郁結(jié)等原因使黑色素、色斑等形成，可通過服用養(yǎng)血補(bǔ)血、活血行氣、舒肝解郁的中草藥來減少黑色素的形成[8]。實驗研究發(fā)現(xiàn)多種中草藥提取物中富含美白活性成分，如酚類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、三萜皂苷類等，均具有美白作用，并且可以從多種途徑抑制黑色素生成及促進(jìn)黑色素排出，從而達(dá)到美白效果。如，甘草的有效成分通過有效清除超氧離子和抑制酪氨酸酶的活性美白[9]，白藜蘆醇和熊果苷等通過吸收紫外線減少黑色素的合成[10]等。并根據(jù)這些美白機(jī)制開發(fā)出多種中藥美白產(chǎn)品。現(xiàn)代藥理研究表明百合有抗腫瘤、抗氧化活性、鎮(zhèn)靜及抗應(yīng)激損傷等作用[11-13]。

本研究旨在觀察百合提取液對黑色素合成的影響。有文獻(xiàn)表明Vit C已被證實為酪氨酸酶抑制劑，能從多種途徑抑制黑色素的生成[14]，故本實驗選用Vit C為實驗的對照藥物。研究結(jié)果顯示：湘西龍山百合提取液對小鼠B-16細(xì)胞酪氨酸酶活性有明顯的抑制作用，也能明顯減少B-16細(xì)胞的黑色素生成，表明龍山百合有較好的美白功用，其基本機(jī)制是通過抑制酪氨酸酶活性進(jìn)而減少黑色素的合成。但是，隨著百合提取液濃度的增高，其對小鼠B-16細(xì)胞活性的抑制作用也不斷增加，即細(xì)胞毒性作用增強(qiáng)。因此湘西龍山百合提取液直接作為美白用品是不合適的，湘西龍山百合中的美白物質(zhì)基礎(chǔ)、細(xì)胞毒性物質(zhì)以及其美白的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Xiangxi Longshan Lily on Melanin Content and Tyrosinase Activity in B-16 Melanoma Tumor Cells of Mouse

LIU Chaosheng1,2,GONG Jian3,SHEN Mengjie3
(1.Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.Department of Dermatology,Chongqing TCM Hospital,Chongqing,400010,China;3.Hunan University of Chinese Mediicne,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo observe the effects of different concentrations of Xiangxi Longshan lily extract on cell viability,melanin content and tyrosinase activity in mouse B-16 cells.MethodsThe same passage B-16 mouse melanoma cells were selected and divided into different groups,then different concentrations of lilium extract and vitamin C were added after 3 days.The B-16 cell viability was measured by MTT,B-16 tyrosinase activity in cells was measured by using Maeda's method,and the content of B-16 melanoma cells was conducted by Victoria's method.ResultsThe effect of Xiangxi Lon gshan Lilium extract in inhibiting tyrosinase activity and synthesis of melanin was better than Vitamin C,the difference was statistically significant between groups (P＜0.05),and the inhibition increased with the concentration.Similarly,the cell toxicity from the Xiangxi Longshan Lilium extract was stronger than Vitamin C,a statistically significant difference between the two groups (P＜0.05).ConclusionThe inhibition effect of lily extract on cell viability,tyrosinase activity and concentration of melanin in cells is stronger than vitamin C,and the inhibition effect is positively correlated with the concentration.

lily;Vitamin C;B-16 cells;melanin;tyrosinase

R285.5；R275

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.02.008

2016-05-17

湖南省教育廳科學(xué)研究項目 （13C679）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃重點項目 （201518）；重慶市人社局博士后特別資助基金項目(Xm2015087)；湖南省“十二五”重點學(xué)科開放基金項目（ZXLCXK201508）。

劉朝圣，男，博士，副教授，研究方向：皮膚病中西醫(yī)結(jié)合防治，E-mail:chaoliu2807@sina.com。

本文引用：劉朝圣，龔 堅，申夢潔.湘西龍山百合對小鼠B-16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（2）：145-148.