許雪峰，杜遠(yuǎn)東 ，任杰，楊瀅，黃東萍

（陜西省漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西漢中723000）

·檢驗檢測·

高效液相色譜法同時測定外用傷筋藥水中梔子苷和芍藥苷含量

許雪峰，杜遠(yuǎn)東 ，任杰，楊瀅，黃東萍

（陜西省漢中市食品藥品檢驗檢測中心，陜西漢中723000）

目的建立同時測定外用傷筋藥水中梔子苷和芍藥苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Kromasil 100－5－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動相為乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86），流速為1.0 m L／min，檢測波長為235 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 L。結(jié)果梔子苷和芍藥苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.07～51.80 g／mL(r＝0.999 9)和2.08～51.88 g／mL(r＝0.999 9)；定量限分別為10.35 ng和20.80 ng,檢測限分別為3.10 ng和6.24 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%；平均加樣回收率分別為99.95%(n＝6)和99.56%(n＝6)；RSD分別為1.15%和0.44%(n＝6)。結(jié)論該方法操作簡便、準(zhǔn)確、專屬性強、重復(fù)性好，可用于測定外用傷筋藥水中梔子苷和芍藥苷的含量。

高效液相色譜法；外用傷筋藥水；梔子苷；芍藥苷；含量測定

外用傷筋藥水為陜西漢中勉縣骨傷科醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑，由制川烏、制草烏、羌活、梔子、赤芍、木瓜、半夏等15味中藥組方，具有活血、通絡(luò)、止痛的功效，主要用于治療各種跌打損傷引起的經(jīng)絡(luò)攣縮、筋骨酸痛、風(fēng)濕麻木及軟組織損傷。方中重用梔子和赤芍，其中梔子有涼血解毒功效，可外用消腫止痛[1]；赤芍能清熱涼血、散瘀止痛，多用于跌打損傷[2]。梔子苷和芍藥苷分別為梔子和赤芍中含量較高且與功效有關(guān)的化學(xué)成分，均具有抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用[3－4]。外用傷筋藥水為傳統(tǒng)外用搽劑，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過于落后，僅有鑒別項和檢查項，未確定主要功效成分含量測定指標(biāo)，難以保證制劑質(zhì)量的均一、穩(wěn)定。本研究中參照復(fù)方制劑一測多評的研究思路[5]，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定其主要功效成分梔子苷和芍藥苷的含量，旨在為綜合控制外用傷筋藥水的質(zhì)量提供簡便、快捷的分析方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Kromasil 100－5－C18色譜柱（瑞典Akzo Nobel公司）；BT 25S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；Nexpower 1000型純化水儀（韓國Human公司）；Transferpette可調(diào)移液器（德國Brand公司）；KQ－250DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

外用傷筋藥水（陜西漢中勉縣骨傷科醫(yī)院自制，批號分別為20160401，20160502，20160801，規(guī)格為每瓶100mL）；梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110749－200714）；芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110736－201438，純度為96.4%）；甲醇為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸為分析純（成都科龍化工試劑廠）；水為實驗室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil100－5－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速：1.0 m L／min；檢測波長：235 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取梔子苷和芍藥苷對照品適量，精密稱定，分別置2個100mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲至其充分溶解，放冷，再加甲醇至刻度，搖勻，作為梔子苷對照品貯備液（質(zhì)量濃度為103.60μg／mL）和芍藥苷對照品貯備液（質(zhì)量濃度為103.75μg／m L）。

混合對照品溶液：分別精密量取梔子苷對照品貯備液和芍藥苷對照品貯備液各2.0 m L，置10 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得梔子苷和芍藥苷質(zhì)量濃度分別為20.72，20.75μg／mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密量取外用傷筋藥水樣品2.0mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按外用傷筋藥水的處方比例，以輔料代替梔子和赤芍，根據(jù)其生產(chǎn)工藝流程制備不含梔子和赤芍的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗：分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1?？梢?，在該色譜條件下，供試品溶液與對照品溶液中梔子苷和芍藥苷色譜峰保留時間一致，梔子苷和芍藥苷均能與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，理論板數(shù)均大于10 000，分離度、拖尾因子均符合相關(guān)技術(shù)要求[6]。陰性對照品溶液在梔子苷和芍藥苷出峰時間處無吸收峰。提示其他成分對測定無干擾，該測定方法專屬性好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下梔子苷和芍藥苷對照品貯備液各1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 m L，分別置50m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得梔子苷質(zhì)量濃度分別為2.07，4.14，10.36，20.72，51.80μg／mL，芍藥苷質(zhì)量濃度分別為2.08，4.15，10.38，20.75，51.88μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計算峰面積積分值。分別以梔子苷和芍藥苷質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，梔子苷為Y＝14 532.30X＋690.38，r＝0.999 9（n＝5）；芍藥苷為Y＝14 891.70X－1 120.35，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，梔子苷和芍藥苷質(zhì)量濃度分別在2.07～51.80， 2.08～51.88μg／mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

1.梔子苷2.芍藥苷A.混合對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖

定量限與檢測限考察：分別取2.2項下梔子苷和芍藥苷對照品貯備液適量，逐步稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比為10∶1時，得梔子苷和芍藥苷的定量限分別為10.35，20.80 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時，得梔子苷和芍藥苷的檢測限分別為3.10，6.24 ng。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.67%，0.58%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下同一供試品（批號為20150112）溶液，置室溫下，分別于0，2，4，6，8，12 h時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.81%，0.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取外用傷筋藥水1瓶（批號為20150112），依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄梔子苷和芍藥苷峰面積。結(jié)果梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.85%，1.08%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的外用傷筋藥水樣品（批號為20160401）適量，置25m L容量瓶中，分別加入樣品含量為50%，100%，150%的梔子苷和芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制備6份待測溶液。按抉訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄溶液中梔子苷和芍藥苷峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批外用傷筋藥水，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積值，并用梔子苷和芍藥苷回歸方程分別計算其含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（ g／m L，n＝3）

3 討論

3.1 測定指標(biāo)選擇

中藥復(fù)方制劑的組方是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下形成的，所含成分復(fù)雜，其臨床療效為多種成分綜合作用的結(jié)果，任意成分含量發(fā)生變化都會影響藥效。中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價長期以來多以單一指標(biāo)成分進(jìn)行控制，而中藥多成分的復(fù)雜性決定了單一成分指標(biāo)評價難以表達(dá)中藥的質(zhì)量，難以真正體現(xiàn)中藥的多效性和整體性[7]。中藥多靶點的作用特點要求對其進(jìn)行多成分質(zhì)量控制，應(yīng)選擇多個有效成分或主要成分作為復(fù)方制劑的定量指標(biāo)，才能更真實地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量，特別是對與功效相關(guān)的化學(xué)成分[8]。

梔子苷和芍藥苷為外用傷筋藥水主要化學(xué)成分，現(xiàn)代研究顯示，其藥理作用與外用傷筋藥水的功效基本一致。根據(jù)含量測定項選定原則[9]，本試驗中選取梔子苷和芍藥苷2個化合物作為指標(biāo)成分，能在一定程度上反映出制劑的整體質(zhì)量，較測定單一指標(biāo)成分更科學(xué)，彌補了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項的不足。

3.2 色譜條件選擇

試驗過程中分別對甲醇－水[10]、甲醇－0.1%磷酸溶液[11]、乙腈－水[12]及乙腈－0.1%磷酸溶液[13]等不同流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，最終發(fā)現(xiàn)，以乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）為流動相，能使其各組分較好地分離，其中磷酸可作為解離抑制劑，抑制組分解離，增強保留。梔子苷和芍藥苷分別屬環(huán)烯醚萜苷和雙環(huán)單萜苷化合物，化學(xué)性質(zhì)相近，二者紫外最大吸收峰波長也較接近，研究顯示，選取235 nm作為檢測波長時得到的色譜峰峰形和響應(yīng)值均較理想。

3.3 含量限度制訂

2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定，梔子藥材中梔子苷含量不得少于1.8%[2]248，赤芍藥材中芍藥苷含量不得少于1.8%[2]158。外用傷筋藥水中梔子和赤芍均為藥材原粉入藥，梔子和赤芍投料量分別為1 200，600 g，浸提精制后灌裝成每瓶100 m L，共制得1 000瓶。按有效成分轉(zhuǎn)移率90%計[14]，根據(jù)投料量及理論含量計算，外用傷筋藥水中含梔子苷應(yīng)不少于194.4μg／mL，含芍藥苷應(yīng)不少于97.2μg／mL。

本試驗中首次同時測定了外用傷筋藥水中梔子苷和芍藥苷的含量，方法可操作性強，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于外用傷筋藥水的質(zhì)量控制。外用傷筋藥水處方包含中藥較多，成分復(fù)雜，受對照品和試驗條件限制，本試驗中選取2種化學(xué)成分作為含量測定指標(biāo)，略顯不足，但填補了含量測定項的空白，后續(xù)試驗中可探索不同方法同時測定更多化學(xué)成分，從多方面控制其質(zhì)量，以確保其臨床藥效穩(wěn)定發(fā)揮。

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Content Determ ination of Geniposide and Paeoniflorin in Shangjin Lotion by HPLC

Xu Xuefeng，Du Yuandong，Ren Jie，Yang Ying，Huang Dongping
（Hanzhong Center for Food and Drug Control，Hanzhong，Shaanxi，China 723000）

Objective To establish an HPLC method for content determination of geniposide and paeoniflorin in Shangjin Lotion.M ethods The HPLC method was adopted on the column of Kromasil 100－5－C18colomn（250 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of acetonitrile－0.1%phosphoric（14∶86）at a flow rate of 1.0 m L／min，the detection wavelength was 235 nm，the column temperature was 25℃，the injection volume was 10μL.Resu lts The linear range was 2.07－51.80μg／m L for geniposide（r＝0.999 9）and 2.08－51.88μg／mL for paeoniflorin（r＝0.999 9）；limits of quantification were 10.35 ng，20.80 ng，limits of detection were 3.10 ng，6.24 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%.The average recoveries were 99.95%（RSD＝1.15%，n＝6）and 99.56%（RSD＝0.44%，n＝6）.Conclusion The method is easy to operate，accurate，specific and reproducible for the content determination of geniposide and paeoniflorin in Shangjin Lotion.

HPLC；Shangjin Lotion；geniposide；paeoniflorin；content determination

R284.1

A

1006－4931(2017)10－0035－04

2017－01－06；

2017－02－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.009

許雪峰，男，主管藥師，研究方向為藥物分析，（電子信箱）792623448＠qq.com。

杜遠(yuǎn)東，男，碩士研究生，藥師，研究方向為藥物分析，（電子信箱）409449431＠qq.com。