金賢武，張繼紅，黃道明

（江西省上饒市食品藥品檢驗(yàn)所，江西上饒334000）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸含量

金賢武，張繼紅，黃道明

（江西省上饒市食品藥品檢驗(yàn)所，江西上饒334000）

目的建立同時(shí)測(cè)定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用Phenomonex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 m L／min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸質(zhì)量濃度分別在1.37～68.50，0.87～43.60 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加樣回收率分別為101.04%和98.78%，RSD分別為2.11%和1.68%(n＝6)。結(jié)論該試驗(yàn)所建立的方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可為消炎利膽膠囊的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

高效液相色譜法；消炎利膽膠囊；綠原酸；迷迭香酸；含量測(cè)定；質(zhì)量控制

消炎利膽膠囊為市售中藥復(fù)方制劑，屬國(guó)家中藥保護(hù)品種。該制劑由穿心蓮、溪黃草、苦木3味中藥經(jīng)加工提取制成，具有清熱、祛濕、消炎利膽之功效[1]，用于治療由肝膽濕熱引起的口苦、脅痛、急性膽囊炎、膽管炎，療效較好[2]。據(jù)報(bào)道，穿心蓮中含有綠原酸等酚酸類成分[3]，溪黃草中含有咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分[4]，苦木中含有生物堿類成分[5]。藥理活性研究表明，綠原酸具有廣泛的抗菌、消炎、止血作用，可顯著刺激膽汁的分泌，具有利膽之功效[6]；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[7]，常作為中藥及制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[8－11]。目前，消炎利膽膠囊的質(zhì)量控制方法為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS3－135（Z－135）－2002Z－2011[12]。標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中穿心蓮、溪黃草、苦木藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)方中穿心蓮的主要成分——穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量進(jìn)行測(cè)定[13]。由于中藥復(fù)方所含化學(xué)成分多樣復(fù)雜，各成分之間具有協(xié)同作用，僅以一種或單類有效成分無(wú)法全面表征中藥制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量[14]。故本試驗(yàn)中以穿心蓮中的綠原酸和溪黃草中的迷迭香酸為指標(biāo)性成分，建立其HPLC含量測(cè)定方法，為消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型高效液相色譜儀，包括Waterse2489檢測(cè)器，Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；CPA225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ－500DE型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；純水儀（易普易達(dá)科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110831～201204）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)為111871～201404）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均不小于98%；消炎利膽膠囊（哈爾濱一洲制藥有限公司，批號(hào)為150904，141205，150609，141007、131003，141004）；甲醇(Merck公司)為色譜純；磷酸、分析甲醇為北京化工產(chǎn)品；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomonex?C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液；流速：1.0 m L／min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相采用如下梯度洗脫程序：0～26 min，6%～22%A；26～58 min，22%～26%A。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取綠原酸、迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為68.5，43.6μg／mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：取消炎利膽膠囊10粒，混勻，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置100 m L容量瓶中，加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，冷卻，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：依據(jù)處方制備缺穿心蓮、溪黃草的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，注入HPLC儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，2種被測(cè)成分能完全分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

1.綠原酸2.迷迭香酸A.對(duì)照品溶液B.供試品溶液C.陰性對(duì)照品溶液圖1高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別精密吸取10μL注入HPLC儀分析，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果綠原酸進(jìn)樣質(zhì)量濃度在1.37～68.50μg／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝33 270X－3 394，r＝0.999 9(n＝6)；迷迭香酸進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.872～43.60μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝32 918X＋5 116，r＝0.999 8 (n＝6)。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為0.82%和1.66%(n＝6)，表明儀器精密度良好。詳見表1。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果，綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為1.03%和1.24%(n＝7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。詳見表2。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為1.18%和1.98%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。詳見表3。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品6份，每份約0.5 g，按1∶1的比例加入對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批次樣品約1.0 g，每個(gè)批次平行取3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表5。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（， g／g，n＝3）

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（， g／g，n＝3）

含量（mg／g）迷迭香酸0.3891±0.007 0.3369±0.008 0.2012±0.005 0.3245±0.004 0.4556±0.005 0.2274±0.006批號(hào)150904 141205 150609 141007 131003 141004綠原酸1.2087±0.023 1.5364±0.031 0.7894±0.018 0.9645±0.024 1.1439±0.032 0.5347±0.011

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分選擇

綠原酸為穿心蓮藥材中的有效成分，具有廣泛的抗菌、消炎作用，可顯著刺激膽汁分泌，具有利膽之功效。迷迭香酸為溪黃草藥材中的主要有效成分，藥理活性研究表明其具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等活性。2種成分是消炎利膽膠囊發(fā)揮消炎利膽功效的主要活性成分，含量的高低會(huì)影響臨床療效，故選擇綠原酸和迷迭香酸作為指標(biāo)性成分，能有效反映消炎利膽膠囊的質(zhì)量，為消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，綠原酸最大吸收波長(zhǎng)為327 nm，迷迭香酸最大吸收波長(zhǎng)為330 nm。本研究中，在采用330 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，綠原酸和迷迭香酸能同時(shí)成為主要吸收峰，分離度較好，峰形良好，且其他物質(zhì)對(duì)綠原酸和迷迭香酸的測(cè)定無(wú)干擾，能達(dá)到測(cè)定要求，故選擇330 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相選擇

綠原酸和迷迭香酸均為弱酸性成分，在流動(dòng)相中加入一定的酸能抑制其電離，改善峰型。參照文獻(xiàn)[15－16]，本試驗(yàn)中考察了甲醇－酸水，乙腈－酸水2種流動(dòng)相。結(jié)果表明，乙腈較甲醇更能使被測(cè)成分達(dá)到完全分離，且柱壓小、基線平，各色譜峰的分離度和理論板數(shù)均能達(dá)到要求，故最終選擇乙腈－0.1%磷酸為流動(dòng)相。

3.4 提取條件選擇

本試驗(yàn)中先對(duì)甲醇和乙醇2種提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示甲醇的提取效率高于乙醇。鑒于綠原酸和迷迭香酸中均含有羥基等親水性取代基，具有一定的水溶性，故本試驗(yàn)中考察了50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇3種不同濃度的甲醇溶劑。結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，2種被測(cè)成分提取率最高；同時(shí)本試驗(yàn)中還對(duì)提取方法（超聲、回流）、提取時(shí)間（30，45，60min）、料液比（1∶25，1∶50）進(jìn)行了考察。最終選擇以50倍量70%甲醇超聲提取30min，被測(cè)成分提取完全，且耗時(shí)少。

3.5 方法評(píng)價(jià)

HPLC法同時(shí)測(cè)定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸的含量，方法穩(wěn)定可行，靈敏度高，重復(fù)性好，分離效果強(qiáng)，其他組分干擾小，回收率高，且操作簡(jiǎn)便、快速，可為消炎利膽膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供理論依據(jù)。含量測(cè)定結(jié)果表明，不同批次的消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸的含量存在顯著差異，進(jìn)一步說(shuō)明僅以穿心蓮內(nèi)酯類成分進(jìn)行質(zhì)量控制并不能完全保證消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量。

[1]田軍，孫備，楊士友，等.消炎利膽膠囊藥效學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1999，10（10）：724－725.

[2]龍子江，方金紅，高建.等.消炎利膽膠囊利膽抗炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)脾胃雜志，2000，8（1）：34－35.

[3]靳鑫，時(shí)圣明，張東方，等.穿心蓮化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2012，43（1）：164－169.

[4]朱德全，黃松，陳建南，等.不同品種、不同產(chǎn)地溪黃草咖啡酸與迷迭香酸的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（2）：114－117

[5]陳猛，范華英，戴勝軍，等.苦木生物堿的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2007，38（6）：807－810.

[6]趙金娟，戴雪梅，曲永勝，等.綠原酸藥效學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2013，32（4）：1－5.

[7]吳建章，郁建平，趙東亮.迷迭香酸的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：383－387.

[8]余晟嵐，徐果.反相高效液相色譜法測(cè)定金嗓口服液中綠原酸含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2015，24（10）：65－66.

[9]李永偉，何兵，周德兵，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定魚腥草中綠原酸和金絲桃苷含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2015，24（7）：49－51.

[10]陳琴華，熊琳，李鵬.HPLC測(cè)定五靈膠囊中迷迭香酸的含量[J].中國(guó)藥師，2015，18（12）：2182－2184.

[11]孫菲，孫欣，金榮.反相高效液相色譜法測(cè)定香菊膠囊中迷迭香酸含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（7）：43－45.

[12]WS3－135（Z－135）－2002（Z）2004，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[13]陳華.HPLC法測(cè)定消炎利膽膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].醫(yī)學(xué)美學(xué)美容，2013（12）：44－45.

[14]邵建強(qiáng).中藥指紋圖譜的研究進(jìn)展[J].中草藥，2009，40（6）：994－998.

[15]靳如義，安萬(wàn)學(xué)，潘相華.HPLC法測(cè)定夏枯草口服液中迷迭香酸的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（6）：1010－1012.

[16]劉煥霞，王冬梅，苗秋艷.HPLC法同時(shí)測(cè)定神康寧丸中4種成分的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，33（3）：226－231.

Content Determ ination of Chlorogenic Acid and Rosm arinic Acid in Xiaoyan lidan Capsules by HPLC

Jin Xianwu，Zhang Jihong，Huang Daoming
（Shangrao Food and Drug Inspection，Shangrao，Jiangxi，China 334000）

Objective To establish an HPLC method for content determination of chlorogenic acid and rosmarinic acid in Xiaoyanlidan Capsules.M ethod The phenomonex?－C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）was adopted，the mobile phase was composed of acetonitrile（A）－0.1%phosphoric acid（B）solution with gradient elution，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 30℃，the detecting wavelength was set at 330 nm.Results The ranges of calibration curve of chlorogenic acid and rosmarinic acid were 1.37－68.50，0.87－43.60μg／mL，with the average recoveries of 101.04%and 98.78%，RSDs were 2.11%and 1.68%，respectively（n＝6）.Conciusion The method is accurate，reliable and repeatable，which can provide a more comprehensive basis for quality control of Xiaoyanlidan Capsules.

HPLC；Xiaoyanlidan Capsules；chlorogenic acid；rosmarinic acid；content determination；quality control

R927.2；R975＋.5

A

1006－4931(2017)10－0031－04

2017－02－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.008

江西省上饒市科技局支撐項(xiàng)目[20162CZD12]。

金賢武，男，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量分析，（電子信箱）jinxianwu2016＠163.com。

黃道明，男，大學(xué)本科，副教授，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量分析，（電子信箱）737259639＠qq.com。