侯小梅，馮安勇，嚴(yán)海元，冷崇姣

（1.重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶402160；2.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院第三分院，重慶402160）

·實驗研究·

別嘌醇聯(lián)合5－氟尿嘧啶對肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響

侯小梅1，馮安勇2，嚴(yán)海元1，冷崇姣1

（1.重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶402160；2.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院第三分院，重慶402160）

目的研究別嘌醇（allopurinol，Allo）聯(lián)合5－氟尿嘧啶（5－Fu）對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法用不同質(zhì)量濃度和配伍的別嘌醇、5－Fu處理HepG2細(xì)胞，用CCK－8法檢測細(xì)胞增殖，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果單用別嘌醇對HepG2細(xì)胞增殖有微弱的抑制作用；別嘌醇與5－Fu聯(lián)用能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并具有質(zhì)量濃度（1～3 g／L）和時間（24，48，72 h）依賴性，兩藥聯(lián)用比單用5－Fu時抑制率更高；別嘌醇與5－Fu聯(lián)用時HepG2細(xì)胞的凋亡率為39.17%，高于單用5－Fu的30.86%（P＜0.05）。結(jié)論別嘌醇與5－Fu聯(lián)用對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制和凋亡具有增強作用。

5－氟尿嘧啶；別嘌醇；HepG2細(xì)胞；增殖；凋亡

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，死亡率高，發(fā)病率位居惡性腫瘤第3位。5－氟尿嘧啶（5－Fluorouracil，5－Fu）作為常規(guī)化學(xué)治療（簡稱化療）藥物長期用于治療原發(fā)性肝癌，但化療藥物的非特異性及腫瘤的耐藥性會導(dǎo)致化療過程中產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且治療效果欠佳[1－4]。據(jù)報道，別嘌醇（allopurinol，Allo）配合5－Fu化療能有效減少5－Fu導(dǎo)致的膀胱炎、黏膜炎、骨髓毒性、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)，化療前使用Allo也是預(yù)防腫瘤溶解綜合征的常規(guī)方法，Allo也是一種治療腫瘤的輔助常用藥[5－9]。本研究擬通過觀察Allo聯(lián)合5－Fu對HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測藥物作用后的細(xì)胞和未處理細(xì)胞的凋亡率，探討Allo聯(lián)合5－Fu對肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的機制，以減少不良反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

酶標(biāo)儀（Sunrise，奧地利Tecan公司）；FACScan型流式細(xì)胞儀（Ecton－Dickinson公司）。人肝癌細(xì)胞株HepG2由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室提供；RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；Allo（北大國際醫(yī)院集團(tuán)西南合成制藥股份有限公司，純度為99.8%，藥用級），用0.1 mol／L NaOH溶液溶解后加RPMI1640培養(yǎng)液配制貯備液備用（pH＝7.0）；5－Fu（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；CCK－8（東仁化學(xué)科技＜上海＞有限公司）；Annexin V、碘化丙啶（PI，Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞用不同質(zhì)量濃度Allo和5－Fu處理。

1.2.2 HepG2細(xì)胞增殖影響試驗(CCK－8法)

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞4×103／mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，根據(jù)所加藥物濃度不同，分為5－Fu組、Allo組、聯(lián)合(Allo＋5－Fu)組、空白組。用RPMI1640培養(yǎng)液配制藥物，藥物終質(zhì)量濃度：5－Fu組為250μg／mL；Allo組為1，2，3μg／mL；聯(lián)合組為1＋250，2＋250，3＋250μg／m L；空白組加入等體積培養(yǎng)液，然后分別加入96孔培養(yǎng)板（每孔100μL）。每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃及5%CO2條件下分別培養(yǎng)24，36，48 h。達(dá)到培養(yǎng)時間后，每孔加入CCK－8 10μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后用酶標(biāo)儀測吸光度（A450值），按公式計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）＝（1－實驗組平均A450值／空白組平均A450值）×100%。

1.2.3 HepG2細(xì)胞凋亡影響試驗(流式細(xì)胞儀)

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期、密度為5×103／m L的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2m L，共4組，每組設(shè)3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，用RPMI1640培養(yǎng)液配制藥物，藥物終質(zhì)量濃度：5－Fu組為250μg／mL；Allo組為3μg／mL；聯(lián)合組為3＋250μg／mL，分別加入到6孔培養(yǎng)板（每孔2m L）；空白組加入等體積培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，以1 500 r／min的速率離心7min，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝7.4）洗滌3次，最后1次移入1m I離心管中，加入Annexin V、PI染色30min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)藥物處理24，48，72 h后，250μg／mL的5－Fu可明顯抑制細(xì)胞的生長，與空白組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。1，2，3μg／m L不同質(zhì)量濃度組的Allo對HepG2細(xì)胞有微弱的抑制作用。當(dāng)5－Fu與不同質(zhì)量濃度的Allo聯(lián)用后，對細(xì)胞生長的抑制作用有一定增強，與空白組及單用5－Fu組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并呈時間和劑量依賴性。結(jié)果表明，Allo與5－Fu聯(lián)用有協(xié)同作用，可增強5－Fu對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。詳見表1。根據(jù)結(jié)果，建議選擇Allo為1μg／m L質(zhì)量濃度，因為聯(lián)合組，Allo質(zhì)量濃度差異對5－Fu的作用不顯著。

表1 各組藥物對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（，n＝3）

表1 各組藥物對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用（，n＝3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與5－Fu組比較，bP＜0.05。

組別質(zhì)量濃度（ g／mL）空白組5－Fu組Allo組24 h 48 h 72 h A450值抑制率（%）A450值抑制率（%）A450值抑制率（%）0 250 123聯(lián)合組1＋250 2＋250 3＋250 0.654±0.007 0.409±0.018a0.648±0.023 0.624±0.003a0.617±0.006a0.387±0.009ab0.356±0.003ab0.325±0.006ab37.46 0.89 4.57 5.64 40.73 45.58 50.27 0.929±0.008 0.566±0.073a0.906±0.029 0.897±0.010a0.868±0.008a0.467±0.036ab0.418±0.033ab0.404±0.017ab39.10 2.55 3.52 6.56 49.78 54.99 56.53 1.080±0.004 0.483±0.014a1.064±0.010 1.032±0.015 0.986±0.006a0.347±0.008ab0.332±0.011ab0.325±0.006ab55.28 1.45 4.40 8.70 67.84 69.26 69.94

2.2 對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

各組藥物作用于HepG2細(xì)胞48 h后，通過流式細(xì)胞儀，用Annexin V／PI染色后檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，5－Fu（250μg／mL）組和聯(lián)合組（3＋250）細(xì)胞早期凋亡及晚期凋亡或壞死細(xì)胞較空白組均明顯增加，凋亡率分別上升為（30.86±1.72）%和（39.17±2.43）%，較空白組的（3.86±0.83）%差異顯著（P＜0.05）。Allo組較空白組細(xì)胞早期凋亡略有增加（P＜0.05），晚期凋亡或壞死細(xì)胞差異性不大（P＞0.05）。兩藥聯(lián)用后，與單用5－Fu組相比，HepG2細(xì)胞的早期凋亡和凋亡率明顯增加（P＜0.05），而晚期凋亡或壞死細(xì)胞增加不明顯（P＞0.05），凋亡率差異顯著（P＜0.05）。詳見表2和圖1。

3 討論

肝癌為常見的消化道腫瘤，具有高死亡率、早期癥狀隱匿、預(yù)后差等特點[10]。5－Fu作為抗腫瘤藥物已應(yīng)用多年，其臨床療效較差，但在目前消化道惡性腫瘤化療中仍為首選，在使用5－Fu常規(guī)劑量進(jìn)行化療時，常會出現(xiàn)消化道不良反應(yīng)及骨髓抑制等不良反應(yīng)，這些都限制了5－Fu在肝癌治療中的應(yīng)用，怎樣合理應(yīng)用目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。因此，尋求一種與5－Fu聯(lián)用后能增強其作用效果，并減少其不良反應(yīng)的新型化療方案在對肝癌的治療上具有積極意義，如何解決化療藥物在治療過程中的耐藥性已成為肝癌治療的關(guān)鍵[11－13]。

表2 各組藥物對HepG2細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）

表2 各組藥物對HepG2細(xì)胞凋亡的影響（，n＝3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與5－Fu組比較，bP＜0.05。

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A.空白組B.Allo組C.5－Fu組D.聯(lián)合組注：縱、橫坐標(biāo)分別為采用PI和Annexin V為染料時的熒光強度。圖1各藥物組對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響（48 h）

本研究通過體外細(xì)胞毒性試驗觀察了Allo、5－Fu單藥及聯(lián)合應(yīng)用對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。CCK－8法檢測結(jié)果表明，與空白組及5－Fu組相比，Allo對肝癌HepG2細(xì)胞生長的抑制作用并不顯著，當(dāng)其與5－Fu聯(lián)合使用后，可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用，提示二者具有協(xié)同增效作用。流式細(xì)胞試驗結(jié)果進(jìn)一步證實，5－Fu與Allo聯(lián)用的抑制率較5－Fu單用時明顯提高，存在抑制增殖機制，可能還存在促細(xì)胞凋亡機制。其機制可能是別嘌醇及其代謝產(chǎn)物異黃嘌呤均能抑制黃嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶是腫瘤增殖促進(jìn)劑，通過抑制黃嘌呤氧化酶從而抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；其次，Allo也可提高肝癌HepG2細(xì)胞對5－Fu的敏感性[14－15]，兩藥聯(lián)用起協(xié)同作用。但本研究僅限于體外試驗，與體內(nèi)具體情況有很大差異，且不同病理類型的肝癌細(xì)胞對藥物的敏感性不同，因此其確切機制還需進(jìn)一步研究。

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Influence of A llopurinol Com bined w ith 5－Fluorouracil on Proliferation and Apop tosis of Liver Cancer HepG2 Cells

Hou Xiaomei1，F(xiàn)eng Anyong2，Yan Haiyuan1，Leng Chongjiao1
（1.Chongqing Yongchuan Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China 402160；2.The Third Branch of Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection，Chongqing，China 402160）

Objective To study the influence of Allopurinol combined with 5－Fluorouracil on the proliferation and apoptosis of liver cancer HepG2 cells.M ethods The HepG2 cells were treated by different concentrations and combinations of Allopwrind，5－Fluorouracil.CCK－8 was used to measure HepG2 cells proliferation，and flow cytometry was used to examine the apoptosis of HepG2 cells.Resu lts The inhibition of HepG2 cells apoptosis reacted by Allopurinol was weak，in combination inhibited the proliferation of HepG2 cells in a time（24，48，72 h）and concentration dependent（1－3μg／L）manner.Allopurinol combined with 5－Fluorouracil had stronger inhibitory effect than that was used alone.The apoptosis rate of HepG2 cells in the combination treatment group was 39.17%，which was significantly higher than 30.86%in the 5－Fluorouracil group（P＜0.05）.Conclusion Allopurinol combined with 5－Fluorouracil has enhanced effect on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells.

5－Fluorouracil；Allopurinol；HepG2 cells；proliferation；apoptosis

R965.2；R979.1

A

1006－4931(2017)10－0018－03

2017－01－29)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.005

侯小梅（1985－），女，碩士研究生，工程師，研究方向為藥物質(zhì)量控制和體內(nèi)分析，（電話）023－49653339。

冷崇姣(1980－)，女，大學(xué)本科，高級工程師，研究方向為藥物細(xì)胞學(xué)，(電子信箱)604033643＠qq.com。