袁方，王國(guó)利，王艷，吳濤，徐佳

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院

細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立與生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)研究

袁方，王國(guó)利，王艷，吳濤，徐佳

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院

目的以原代培養(yǎng)的喉鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞為例，觀測(cè)細(xì)胞癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性。方法通過(guò)組織塊培養(yǎng)法，體外原代培養(yǎng)喉鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞，細(xì)胞傳代超過(guò)25次時(shí)，觀察細(xì)胞的樣態(tài)、細(xì)胞角蛋白的組織化學(xué)染色、檢驗(yàn)細(xì)胞增值周期、培養(yǎng)法檢驗(yàn)支原體、聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR法）鑒別細(xì)胞種類(lèi)、STR-短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型。結(jié)果新建立一株喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，定名為T(mén)R-LCC-1，其大多數(shù)形態(tài)為多邊形細(xì)胞，鋪路石樣變異、疊層生長(zhǎng)，除了形態(tài)區(qū)別于其他細(xì)胞外，其體積也比較大。細(xì)胞角蛋白的組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性。繁衍30代之后，細(xì)胞群體倍增時(shí)間提高到201.2小時(shí)。對(duì)細(xì)胞間期進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DNA合成前期（G1期）占51.71%，DNA合成期（S期）占44.56%，DNA合成后期（G2期）占2.28%。培養(yǎng)法檢驗(yàn)支原體，未發(fā)現(xiàn)污染。聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR法）鑒別TR-LCC-1種類(lèi)屬于人來(lái)源細(xì)胞。對(duì)STR-短串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P26與P6一致，異于已知細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)論人來(lái)源喉鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞系TRLCC-1，可以作為樣本以研究喉鱗狀細(xì)胞癌的特性。

喉腫瘤細(xì)胞；鱗狀細(xì)胞；原代培養(yǎng)；細(xì)胞系；生物學(xué)特性

近些年，我國(guó)癌癥發(fā)病率普遍提高，對(duì)于喉癌等這類(lèi)常見(jiàn)頭頸疾病來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)主要采用手術(shù)與化療結(jié)合治療的方式，但效果不明顯，生存5年以上的比例幾乎未見(jiàn)變化。特別是中晚期喉癌患者，放療之后往往還需要切除病變器官，以致于患者呼吸困難、無(wú)法正常發(fā)音，對(duì)其心理、生理造成雙重影響。所以，提高治療技術(shù)，對(duì)喉腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)研究，尋找新的醫(yī)學(xué)手段，迫在眉睫。對(duì)喉腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，建立喉腫瘤細(xì)胞系，是分析病變細(xì)胞的生物學(xué)特性、形態(tài)特性等的前提條件，但是，當(dāng)前我國(guó)的形勢(shì)是：能夠試驗(yàn)用的喉鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞十分有限，而原來(lái)的Hep-2細(xì)胞株大多數(shù)已經(jīng)被同實(shí)驗(yàn)室的HeLa細(xì)胞系污染，失去了研究?jī)r(jià)值。所以，醫(yī)學(xué)界只能利用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，把建立的新細(xì)胞系取名為T(mén)R-LCC-1，并應(yīng)用于喉癌細(xì)胞的試驗(yàn)研究，分析生物學(xué)特性，鑒別其種類(lèi)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

喉鱗狀細(xì)胞癌組織細(xì)胞，對(duì)未壞死部分進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 癌細(xì)胞組織建系過(guò)程

（1）在無(wú)菌的操作模式下，在未壞死喉癌細(xì)胞組織上取2X2cm的材料標(biāo)本，選取部位要求其顏色為魚(yú)白色、質(zhì)地要統(tǒng)一、柔軟且有光澤。

（2）用無(wú)菌生理鹽水清洗標(biāo)本兩次之后，快速侵入到組織細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)液中（青霉素含量200U/ml,鏈霉素含量200mg/L,二性霉素B含量2mg/L），在4℃條件下，浸泡2h～3h。

（3）無(wú)菌生理鹽水（含青霉素、鏈霉素及二性霉素B）及RP?MI-1640培養(yǎng)基（10%牛血清）分別沖洗三次。

（4）取2個(gè)半徑為2～4mm的癌細(xì)胞組織塊，分別放置在培養(yǎng)瓶底部進(jìn)行組織培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液含10%血清；培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2為5%，濕度飽和。需要注意：2小時(shí)之后，要旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，以便使喉癌組織小塊在培養(yǎng)液中能夠完全浸泡。

（5）一周之后，若貼壁的的喉癌組織小塊中的細(xì)胞融合比例達(dá)到60%，則進(jìn)入細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)階段，頻率為每周1到2次。另外，可用反復(fù)貼壁方法分離、清除成纖維細(xì)胞。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

（1）用蓋玻片接種細(xì)胞，并使其呈單層排列

（2）采用PBS-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉）沖洗細(xì)胞，浸入甲醇-丙酮固定液中，使細(xì)胞保持原有狀態(tài)、結(jié)構(gòu)。

（3）蘇木精-伊紅染色（HE染色）、細(xì)胞角蛋白免疫組化染色。

1.2.3 MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)比色法）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

（1）用胰酶降解、消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段的細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液。

（2）充分混勻細(xì)胞懸液之后，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞顯微計(jì)數(shù)，分別在每個(gè)孔中滴入100ul，采用24孔板，共5張，有序擺放在培養(yǎng)箱（37℃，co2:：5%）內(nèi)，持續(xù)檢驗(yàn)5天。

（3）隔天，在距結(jié)束細(xì)胞培養(yǎng)4h的時(shí)間段，在每個(gè)中孔滴入50mg四甲基偶氮唑藍(lán)溶液。

（4）經(jīng)過(guò)4h之后，用吸管清除培養(yǎng)基液，并在每個(gè)孔中滴入100ul的二甲基亞砜（DMSO）。

（5）置于振蕩器上5～10min，用波長(zhǎng)為570nm的酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.2.4 PI-FACS（碘化丙啶染色法）檢測(cè)細(xì)胞增殖周期

當(dāng)細(xì)胞增殖，使其覆蓋率達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行胰酶蛋白消化處理；離心細(xì)胞5min，1200r/min；用磷酸緩沖鹽溶液（4℃、PH值在7.2～7.4之間）沖洗細(xì)胞組織；在乙醇含量為70%的溶液中固定1h以上；離心細(xì)胞5min，1500r/min；在1.0～1.5ml細(xì)胞染色液中進(jìn)行細(xì)胞重懸，預(yù)計(jì)細(xì)胞的上機(jī)通過(guò)率能在200～350cell/s時(shí)，上機(jī)檢驗(yàn)。

1.2.5 支原體檢測(cè)

利用分離培養(yǎng)法檢驗(yàn)支原體是否被感染，在保障細(xì)胞上機(jī)通過(guò)率為200～350cell/s時(shí)，置于瓊脂平板上，顯微檢測(cè)是否有特征性病變。

1.2.6 STR--短串聯(lián)重復(fù)序列檢測(cè)

提取并分離DNA，檢驗(yàn)其熒光信號(hào)，對(duì)比分析STR。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察

利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞系TR-LCC-1，發(fā)現(xiàn)其大多呈多邊形狀態(tài)，似鋪石路樣疊層增殖。經(jīng)蘇木精—伊紅染色法發(fā)現(xiàn)，其異型性明顯，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)比重加大，核仁數(shù)量突增，不對(duì)稱(chēng)性、三極性及多極性核分裂等現(xiàn)象增加。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

經(jīng)免疫組織化學(xué)細(xì)胞角蛋白染色結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)鱗狀上皮細(xì)胞AE1/AE3值高，由此證明，細(xì)胞系TR-LCC-1歸屬于上皮細(xì)胞。

2.3 體外培養(yǎng)情況

TR-LCC-1細(xì)胞系在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段初始，增殖速度迅速，于第三天達(dá)到頂峰。細(xì)胞倍增時(shí)間達(dá)到201.2小時(shí)。

2.4 細(xì)胞周期分析

周期結(jié)果檢驗(yàn)測(cè)定：G1期為51.7%，S期為44.56%，M期為1.45。

2.5 特性檢測(cè)結(jié)果

支原體（培養(yǎng)法）顯示為陰性。PCR法（聚合酶鏈反應(yīng)法）檢驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞系TR-LCC-1屬于人來(lái)源細(xì)胞。其中P26和P6的STR一致，均區(qū)別于已知細(xì)胞。

3 結(jié)論

喉癌屬于較為多見(jiàn)的一種惡性疾病，具可靠數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率和死亡率都相對(duì)較高[2]。在我國(guó)，目前的主要治療方式還是采用手術(shù)與化療相結(jié)合，但是其效果不夠理想，喉癌患者的死亡率仍居高不下[3]，所以加大喉癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究力度，建立細(xì)胞系，進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，為相關(guān)醫(yī)學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

[1]羅瑞華，齊金星，翟翼飛.中國(guó)居民喉癌死亡水平分析[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2012,（31）:160.