王子賀 鄧曉東 張陽 費(fèi)小雯 ??

摘要[目的] 構(gòu)建萊茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi載體。 [方法]提取萊茵衣藻細(xì)胞總RNA，利用PCR擴(kuò)增出編碼MAPK4的基因片段，用基因工程技術(shù)將MAPK4基因片段連接載體pMD18-T上，經(jīng)過2次不同的雙酶切后，與RNAi中間載體pT282連接，最后連接到干涉載體pMaa7IR/XIR上，用酶切及測(cè)序鑒定MAPK4基因RNAi載體并轉(zhuǎn)化萊茵衣藻。 [結(jié)果]經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及測(cè)序鑒定，證實(shí)為重組質(zhì)粒，并且該重組載體可在萊茵衣藻中表達(dá)。 [結(jié)論]構(gòu)建的MAPK4基因RNAi載體結(jié)構(gòu)正確，為進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)使MAPK4基因沉默表達(dá)，研究MAPK4在萊茵衣藻中的生物學(xué)功能奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞萊茵衣藻；MAPK4基因；RNAi

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）19-0126-04

Construction and Identification of MAPK4 Gene RNAi Vector of Chlamydomonas reinhardtii

WANG Zihe1， DENG Xiaodong2， ZHANG Yang1， FEI Xiaowen1*

（1.College of Basic Medicine and Life Science，Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571101；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101）

Abstract[Objective] To construct a MAPK4 gene RNAi vector of Chlamydomonas reinhardtii 2A38. [Method] Total RNA was extracted from C. reinhardtii， and the MAPK4 gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction（PCR）. By using gene engineering technique， C. reinhardtii MAPK4 gene was inserted to pMD18T vector. The forward and reverse fragments ，which were obtained by two different double enzyme digestion of pMD18T vector， were inserted into the RNAi intermediate vector pT282. The invertedrepeat fragment was digested by enzyme EcoRI and linked to the vector pMaa7IR/XIR.The recombined plasmid was identified by digestion and sequencing. [Result] Through restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing identification， the recombinant vector was successfully constructed， it could be expressed in C. reinhardtii. [Conclusion] The constructed MAPK4 gene RNAi vector has correct structure， which laies the foundation for using RNAi technique to silence the gene expression and further research on MAPK4 biological function in C. reinhardtii.

Key wordsChlamydomonas reinhardtii；MAPK4 gene；RNAi

鐵是自然界生物質(zhì)生長和繁殖不可缺少的元素，在植物中，鐵是最早發(fā)現(xiàn)的必需營養(yǎng)因子。鐵直接或間接參與植物光合、呼吸作用中的光合磷酸化和氧化磷酸化，固氮作用及硝酸鹽還原過程中的電子傳遞，又參與植物的細(xì)胞分裂，影響葉綠體的組成[1-2]。在哺乳動(dòng)物中，鐵的主要作用是運(yùn)載和儲(chǔ)存體內(nèi)的氧和二氧化碳，參與細(xì)胞色素氧化酶等動(dòng)物生長所必需的活化因子的組成，最重要的是參與血紅蛋白和肌紅蛋白的組成[3]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室以萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）為研究對(duì)象，在缺鐵應(yīng)答突變體庫中篩選得到一個(gè)突變體mu9， 已經(jīng)證明該突變體Femu9p基因的缺失是造成報(bào)告基因活性喪失的原因，其編碼蛋白含有絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）結(jié)構(gòu)域，在缺鐵的條件下可以誘導(dǎo)表達(dá)[4]。MAPKKK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的組成部分，故預(yù)測(cè)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與鐵的調(diào)控。MAPK存在于真核生物中，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由MAPK、MAPKK、MAPKKK組成，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，MAPKKK、MAPKK、MAPK通過依次磷酸化作用而被激活[5]，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長發(fā)育、分裂、分化和凋亡等生理活動(dòng)[6]。該試驗(yàn)通過RT-PCR擴(kuò)增萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段，并通過連接、轉(zhuǎn)化等重組方法，構(gòu)建MAPK4基因的干涉載體，為下一步研究MAPK4基因在萊茵衣藻鐵代謝機(jī)制中的作用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

藻株、菌株及載體：所使用的萊茵衣藻2A38是由購自美國杜克大學(xué)衣藻中心的萊茵衣藻 CC425改造而成；E.coli DH5α菌株、載體pT282、RNAi載體pMaa7IR/XIR是由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供；PMD-18T 載體購自TaKaRa 公司。

試劑與儀器：PCR 試劑盒（海南微氪生物科技有限公司），巴龍霉素、5-氟吲哚、L-色氨酸、Trizol、DEPC、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR 產(chǎn)物回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司），HindIII和BamHII等限制性內(nèi)切酶、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒（TaKaRa），Tgradient梯度PCR 儀（Biometra， GER），高速冷凍離心機(jī)，渦旋器，恒溫?fù)u床，六一電泳系統(tǒng)，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2方法

1.2.1

總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。 將2A38藻株接于50 mL的TAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用Trizol法提取萊茵衣藻的總RNA，再用大連寶生物公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段的擴(kuò)增。 根據(jù) Phytozome 數(shù)據(jù)庫公布的MAPK4（Cre17.g745447）的序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增干涉片段的引物為 F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。通過PCR擴(kuò)增用于構(gòu)建RNA載體的干涉片段，反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL， 1×Mix 12.5 μL，Taq酶0.5 μL，DMSO 1 μL ，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3干涉片段與載體pMD18-T連接。 將擴(kuò)增得到的目的片段回收并純化，與載體pMD18-T連接（圖1a），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，得到pMD-18T-MAPK4。

1.2.4正向片段與載體pT282連接。 用HindIII和BamHII分別進(jìn)行雙酶切 pMD-18T-MAPK4和中間載體pT282，切膠回收酶切后的MAPK4正向片段和線性化載體pT282并連接（圖1b），轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，并用HindIII和BamHII雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到pT282-MAPK4正向片段質(zhì)粒。

1.2.5反向片段與載體pT282連接。用XbaI和SalI 雙酶切pMD-18T-MAPK4 和 pT282-MAPK4正向片段重組質(zhì)粒，切膠回收MAPK4反向片段和線性化的pT282-MAPK4 正向片段載體并連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，并用XbaI和SalI雙酶切鑒定。再用EcoRI酶切鑒定，得到由MAPK4干涉片段正反方向插入的中間載體pT282-MAPK4（圖1b）。

1.2.6

正反向重復(fù)片段與載體pMaa7IR/XIR連接。用EcoRI酶切中間載體pT282-MAPK4和RNAi空載體pMaa7IR/XIR，回收MAPK4正反重復(fù)片段和線性化的pMaa7IR/XIR 載體并將回收的載體進(jìn)行去磷酸化處理，然后連接（圖1c），轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單陽性克隆，提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定，得到pMaa7IR/MAPK4IR干涉表達(dá)載體，并測(cè)序鑒定。

1.2.7轉(zhuǎn)化萊茵衣藻及轉(zhuǎn)化后鑒定。 將萊茵衣藻2A38在TAP液體培養(yǎng)基中于25 ℃200 r/min、全光照的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。用玻璃珠法[7]將pMaa7IR/MAPK4IR干涉載體及空載體pMaa7IR/XIR分別轉(zhuǎn)化萊茵衣藻，將轉(zhuǎn)化后的藻細(xì)胞于50 mL離心管，避光溫育過夜。3 000 r/min，離心5 min收集藻細(xì)胞，涂布于含有5 μg/mL巴龍霉素的TAP固體培養(yǎng)基上，全光照培養(yǎng)6～7 d。挑選單克隆藻株，接種于含5 μmol/L 5-氟吲哚、1.5 mmol/L L-色氨酸的TAP固體培養(yǎng)基上篩選，挑取篩選后的單克隆藻株，進(jìn)行目標(biāo)基因MAPK4表達(dá)豐度分析。

1.2.8

轉(zhuǎn)基因藻株MAPK4基因表達(dá)豐度檢測(cè)。 挑選3個(gè)轉(zhuǎn)基因藻株于液體TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒說明書進(jìn)行操作。qPCR引物為F-GCACAGCCTCATAGGAAAGG/R-CCAATCACTGTGTGCAGGTC。反應(yīng)體系為cDNA模板2 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 7.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足至15 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min；4 ℃保溫。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。空載體pMaa7IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻為對(duì)照，18S rRNA為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

2結(jié)果與分析

2.1萊茵衣藻MAPK4基因干涉片段的擴(kuò)增

以萊茵衣藻總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板，以RNAi片段的特異性引物來擴(kuò)增（片段大小273 bp），用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在250～500 bp出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期目的片段大小一致（圖2）。

2.2pMD-18T-MAPK4菌落PCR鑒定

挑取單陽性克隆的菌落當(dāng)模板進(jìn)行菌液PCR，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在250～500 bp處有條帶，且與原先的目的片段大小一致，經(jīng)測(cè)序正確（圖3）。

2.3RNAi正、反向片段的獲得

用2組酶分別雙酶切pMD-18T-MAPK4，將正向片段和反向片段從質(zhì)粒上切下來，然后再進(jìn)行膠回收純化目的片段，并與酶切處理過的pT282連接。酶切質(zhì)粒pMD-18T-MAPK4與pT282所用2組酶分別為 HindIII 和 BamHII（此組酶切下的片段定義為正向片段）、XbaI和 SalI（此組酶切下的片段定義為反向片段）。

2.4正、反向片段與載體pT282連接鑒定

用HindIII和BamHII進(jìn)行雙酶切pT282-MAPK4正 向片段重組質(zhì)粒，電泳分析，在100、250 bp處有條帶，表明正向片段已成功地連接到載體pT282上；用XbaI和SalI 雙酶切pT282-MAPK4正反向片段重組質(zhì)粒，電泳顯示，大小與預(yù)期大小一致，表明反向片段已成功地連接到載體pT282上（圖5）。

2.7干涉載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻后檢測(cè)結(jié)果

提取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用qPCR法檢測(cè)萊茵衣藻MAPK4基因mRNA的表達(dá)量。由圖8可知，3個(gè)干涉載體pMaa7IR/MAPK4IR轉(zhuǎn)基因藻菌與空載體pMaa7IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻菌相比，MAPK4的mRNA表達(dá)量分別下降了7960%、83.40%、74.70%，說明沉默效果較好。

3討論

目前，基因敲除已經(jīng)成為研究基因功能不可缺少的工具，而RNA干涉技術(shù)又是比較理想的可以使目的基因沉默的工具。RNA干涉（RNA interference，RNAi）是指利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型的技術(shù)[8]，其已經(jīng)應(yīng)用于基因功能研究、疾病治療和藥物開發(fā)與應(yīng)用等方面[9]。

與鐵代謝相關(guān)的MAPK的報(bào)道主要集中在人類癌細(xì)胞

的研究方面。研究發(fā)現(xiàn)缺鐵將導(dǎo)致肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)

胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有絲分裂中斷，并誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡，

所以目前臨床上采用鐵螯合劑desferrioxamine（DFO）或Dp44mT治療上述癌癥[10-12]。缺鐵信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過ASK1（MAPKKK）激活JNK和p38MAPK級(jí)聯(lián)途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[13]。除了在癌細(xì)胞研究方面，在植物、微藻和酵母的鐵代謝調(diào)控研究領(lǐng)域，對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與鐵代謝的報(bào)道還不多。

綜上所述，有必要研究MAPK4在萊茵衣藻缺鐵應(yīng)答調(diào)控機(jī)制中的作用。該研究擴(kuò)增萊茵衣藻MAPK4基因的干涉片段且成功構(gòu)建MAPK4-RNAi載體，并轉(zhuǎn)入萊茵衣藻里，為進(jìn)一步研究MAPK4在萊茵衣藻缺鐵應(yīng)答調(diào)控中的作用和生物學(xué)功能奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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