徐暢　廖依依　張英霞　鄧世明　宋彥廷

摘要對不同天然產(chǎn)物中熊果酸和齊墩果酸的提取純化方法及分析方法進行綜述，并比較了各方法的優(yōu)缺點。

關(guān)鍵詞天然產(chǎn)物；熊果酸；齊墩果酸；提取純化方法；分析方法

中圖分類號R284文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0113-03

Research Progress of Extraction and Analysis Methods of Oleanolic Acid and Ursolic Acid from Natural Products

XU Chang， LIAO Yiyi， ZHANG Yingxia， SONG Yanting* et al

（Key Laboratory of Tropical Biological Resources of the Ministry of Education， Department of Pharmaceutical Sciences， College of Marine Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

AbstractThe extraction purification and analysis methods of oleanolic acid and ursolic acid from different natural products were summarized， and the advantages and disadvantages of each method were compared.

Key wordsNatural products；Ursolic acid；Oleanolic acid；Extraction purification methods；Analysis method

齊墩果酸（oleanolic acid，OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）是互為異構(gòu)體的2種五環(huán)三萜類化合物，常同時存在于同一種藥用植物中。齊墩果酸具有降血糖、消炎、局部止血等作用[1]，熊果酸也在各項研究中被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒、抗炎抑菌等藥理作用[2]。因此，對于同時含有OA和UA的藥用植物而言，建立一種有效的提取分離測定方法是必不可少的。筆者通過對不同藥用植物中OA和UA的提取分離方法進行綜述，并總結(jié)了各檢測手段的優(yōu)缺點，旨在為含OA和UA的天然產(chǎn)物的藥效研究提供試驗基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

1提取純化方法研究

1.1溶劑提取

1.1.1超聲波強化溶劑提取。超聲波強化提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的強振動、高速度、快攪拌以及空化效應(yīng)等作用，使藥物有效成分快速進入溶劑，具有操作簡便、快速、使用溶劑少、產(chǎn)率高、提取溫度低等優(yōu)點[3]，當改變提取溶劑的類型和配比時，還能用于廣范圍中藥有效成分的提取。李坤平等[4]利用超聲波強化溶劑成功提取了姜味草中OA和UA，并且優(yōu)化了提取工藝，以乙醇作為溶劑時，提取的最佳條件是：乙醇體積分數(shù)為90%，固液比為1∶15，功率為360 W，頻率為40 kHz，使用超聲波提取2次，每次20 min，OA和UA總得率為0.732%；與回流提取相比，產(chǎn)率有所提高，操作方法、試驗條件也更簡便。霍文蘭等[5]利用超聲波溶劑提取技術(shù)提取了山楂果中OA和UA，并利用正交分析法對提取條件進行了優(yōu)化，在最佳條件下，提取出OA、UA的含量分別為1522、4.782 mg/g。

1.1.2微波輔助萃取。微波輔助萃取技術(shù)是通過利用微波能加熱且升溫均勻快速等優(yōu)點，來提高萃取效率的，不同物質(zhì)對微波能的吸收程度不同，特定加熱基體物質(zhì)的某些組分，從而呈現(xiàn)出較好的選擇性[6]。

黃建林等[7]使用微波萃取技術(shù)提取了番石榴葉中的OA和UA，優(yōu)化后的微波萃取條件為60～80 mesh番石榴葉、10 mL 乙醇、80 ℃和10 min；與索氏萃取得到的產(chǎn)率相當，但時間僅為索氏萃取的1/24。汪文浩等[8]利用微波輔助技術(shù)提取了枇杷花中OA和UA，并對提取條件進行優(yōu)化后，OA和UA提取量分別達0.482、3118 mg/g。

1.1.3加速溶劑萃取。加速溶劑萃取技術(shù)具有耗時短、樣品和溶劑使用量少、有機溶劑不易暴露等特點，并且通過提溫和加壓，萃取效率明顯提高[9]。王文俊等[10]利用加速溶劑萃取技術(shù)提取了女貞子中的齊墩果酸和熊果酸，優(yōu)化后的萃取條件為：萃取壓力6.9 MPa，萃取溫度為100 ℃，萃取時間為5 min，萃取次數(shù)為2次；優(yōu)化后的緩沖體系為40 mmol/L 硼砂、1 mmol/L β-環(huán)糊精、pH 9.5、6%甲醇。將該法與索氏提取及超聲提取所得結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)該法的產(chǎn)率高于超聲提取，雖與索氏提取的產(chǎn)率相近，但該法的樣品用量少、提取時間短。

1.1.4分散液相微萃取。分散液相微萃取是目前倡導(dǎo)的環(huán)境友好型 “綠色化學(xué)”技術(shù)，它包含分散劑、萃取劑和含分析物的樣品這3個體系，能將萃取、純化、濃縮一步到位，具有操作簡單、低毒、價廉等特點[11-12]。

郝耀梅[13]使用分散液相微萃取技術(shù)-高效液相色譜成功測定了中草藥枇杷葉和白花蛇舌草中OA和UA的含量，并對萃取條件進行了優(yōu)化，當萃取劑為氯仿、體積為70 μL，分散劑為甲醇、體積為300 μL，供相體積為5 mL、pH為2，鹽濃度為10%、萃取時間為2 min、離心轉(zhuǎn)速為1 500 r/min、時間為4 min時，富集倍數(shù)分別達1 378和933。賈小燕等[14]利用基于離子液體的分散液相微萃取技術(shù)提取了藍花楹中的OA和UA，并對提取工藝進行優(yōu)化，OA和UA提取量分別達2.96、1.147 mg/g。

1.2固相萃取

固相萃取是樣品前處理中應(yīng)用廣泛的方法之一，該方法能將痕量被測組分進行濃縮（富集），并對樣品組成進行簡化，將介質(zhì)進行轉(zhuǎn)移[15]。

1.2.1

C18固相萃取劑。盛靈慧等[16]利用固相萃取-高效液相色譜測定棗中OA和UA，樣品經(jīng)乙醇提取后，減壓濃縮，C18固相萃取小柱凈化后，有效去除了棗中多糖、黃酮、皂苷等與目標分析物性質(zhì)相似的化合物，為后期色譜手段分離測定提供了條件。

1.2.2硅膠固相萃取劑。江鐵軍[17]利用固相萃取-反向高效液相色譜測定了女貞子中OA和UA的含量，使用硅膠作為固相萃取的填料，成功消除了女貞子藥材中雜質(zhì)成分的干擾；試驗還對11種不同來源的女貞子中OA和UA進行測定，發(fā)現(xiàn)含量有20倍以上差異。

1.2.3分子印跡聚合物固相萃取劑。分子印跡聚合物（MIPs）是一種具有預(yù)定選擇性、專一選擇性、高度穩(wěn)定性且使用壽命長的新型材料，通過使用這種材料，大大降低了非特異性吸附對選擇性的影響，減少“包埋”現(xiàn)象，使目標化合物能成功地被洗脫和識別出來[18-21]。

楊律文等[22]通過將UA為模板分子，4-乙烯基吡啶（4-VP）為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，利用表面分子印跡技術(shù)，合成出一種表面分子印跡聚合物，這種聚合物對于UA選擇性極高。通過對復(fù)合物進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)當功能單體濃度增大時，UA的紫外特征吸收峰也相對增強，并且出現(xiàn)紅移現(xiàn)象；該研究還將熊果酸及其類似物OA都在MIPs上進行吸附和洗脫，除去OA，對UA進行富集和分離，發(fā)現(xiàn)UA的富集因子提高了30倍，而非分子印跡聚合物（NMIPs）柱則不具有這種選擇性。

張朝暉等[23]以聚乙烯醇修飾的多壁碳納米管（MWCNTs）為基材，UA為模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，在碳納米管表面，成功合成出對UA選擇性高的分子印跡聚合物（MWCNTs-MIPs）；將該印跡物裝填于固相萃取柱中，可將OA和UA進行分離；并對萃取條件進行了優(yōu)化，淋洗液為100%甲醇、洗脫液為10%乙酸-甲醇時，回收率是最高的。

2分析方法研究

2.1薄層色譜法

薄層色譜法具有簡便、易行、專屬、靈敏等特點，是應(yīng)用最為廣泛的分離測定方法。嚴華等[24]使用薄層色譜法，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（200∶5.0∶8.0∶0.1）為展開劑展開，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 °C加熱顯色，在大棗、女貞子、連錢草、馬鞭草、山茱萸、山楂、夏枯草7種藥材中均同時檢出OA和UA；該方法對于含有這2種成分的中藥成方制劑也是同樣適用的。都述虎等[25]以氯仿-甲醇（40∶1）為展開劑，10%硫酸乙醇液為顯色劑，利用雙波長薄層掃描法，測定波長（λS）為640 nm，參比波長（λR）為535 nm，成功測定了木瓜中OA的含量；同時還對比了不同產(chǎn)地木瓜中OA的含量，發(fā)現(xiàn)宣木瓜中OA含量最高，而產(chǎn)地相同、粒度不同的木瓜中，OA的含量也有很大差異。

2.2膠束毛細管電泳色譜法

膠束毛細管電泳（MECC）色譜是一種通過將表面活性劑加入到電泳緩沖溶液中，當其濃度超過臨界膠束濃度時，分子間的疏水基團聚集形成膠束，溶質(zhì)由于在膠束相以及水相間分配系數(shù)不同，從而得以分離；該方法具有高效、快速、操作簡便等特點。

肖美添等[26]通過將改性環(huán)糊精類化合物加入運行緩沖液中，大大提高了MECC的分離能力，并將此法成功運用于測定枇杷葉中OA和UA的含量，回收率分別為97.8%（RSD為2.9%）和981%（RSD為3.3%）。

王瑞等[27]利用膠束電動毛細管色譜法測定了茱萸中OA和UA，最佳操作條件為 60 mmol/L十二烷基硫酸鈉、2.5 mmol/L磷酸二氫鈉、2.5 mmol/L硼砂、8 mmol/L二甲基-β-環(huán)糊精、8 mmol/L β-環(huán)糊精和30%（V/V）異丙醇，加樣回收率OA為99.30%～101.85%，UA為9830%～98.59%。

2.3氣相色譜法

OA和UA分子中都含有羧基和羥基，揮發(fā)性差，不適合氣相色譜直接測定。閆花麗等[28]利用重氮甲烷為衍生化試劑，將OA和UA制成甲酯衍生物，該衍生物具有易氣化的特點，通過氣相色譜法-氫焰檢測器進行檢測，成功測定了夏枯草中的OA和UA，回收率分別為8353%（RSD為3.5%）、94.18%（RSD為3.0%）。

黃建林等[29]使用雙（三甲硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）為衍生化試劑，將OA和UA制成三甲基硅烷衍生物，該衍生物具有易氣化的特點；然后采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，對番石榴葉中的OA和UA進行了定性和定量測定，回收率分別為771% 和89.4%（RSD分別為3.7%和3.5%）。

2.4高效液相色譜

高效液相色譜（HPLC）廣泛應(yīng)用于定量定性分析的各個領(lǐng)域，具有以下檢測器：紫外波長檢測器（UV）、二極管陣列檢測器（DAD或PDA）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。

2.4.1

HPLC-UV。王雨梅等[30]建立了快速測定毛建草中OA和UA含量的HPLC-UV方法。選用ODS色譜柱，乙腈-甲醇-水-醋酸銨（70∶14∶16∶0.05）為流動相，檢測波長為210 nm，OA和UA的回收率分別為99.5%（RSD為20%）、100.6%（RSD為2.2%）。該方法對于進一步開發(fā)和利用蒙藥植物資源具有重大意義。

2.4.2

HPLC-DAD（PDA）。羅智敏等[31]利用HPLC-DAD測定血滿草中OA和UA含量，并進行方法學(xué)考察。選用Fusion-RP C18柱，甲醇-0.2%磷酸水溶液（90∶10）為流動相，檢測波長為210 nm，回收率分別為101.4% 和98.3%（RSD分別為0.72% 和1.13%）；對血滿草不同部位中OA和UA的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)血滿草花中OA和UA含量最高，而根中含量最低。王歡等[32]利用HPLC-DAD同時測定了白花蛇舌草中OA和UA，發(fā)現(xiàn)OA和UA的平均回收率分別為98.17%（RSD為1.89%）、99.31%（RSD為2.62%）。

2.4.3

HPLC-ELSD。趙韶華等[33]建立了HPLC-ELSD法同時測定連翹葉中OA和UA，選用Waters Symmetry C18柱，甲醇-0.4%冰醋酸溶液（93∶7，V/V）為流動相，檢測波長為210 nm，OA和UA的回收率分別為98.67%和98.56%（RSD分別為2.61% 和1.64%）；該方法操作簡便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好。廖壹[34]利用HPLC-ELSD同時測定了澤蘭中OA和UA的含量，在優(yōu)化的條件下，OA和UA獲得較好的分離，且該方法準確、重現(xiàn)性好。

2.4.4HPLC-MS。楊曉靜等[35]建立了一種同時檢測中藥材中齊墩果酸和熊果酸含量的超高效液相色譜-三級四極桿質(zhì)譜（UPLC-TQMS）方法；選用Waters Acquity UPLC BEH C18柱，乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液（氨水調(diào)至pH 9.24）為流動相，梯度洗脫，負離子模式下檢測；齊墩果酸和熊果酸的回收率分別為101.1%和100.8%（RSD分別為1.80% 和0.04%）；使用該法對10種不同中藥材中齊墩果酸和熊果酸含量進行檢測，與已報道方法相比，該方法具有有機溶劑用量少、干擾小、準確度高且超高效分離的特點。李成等[36]開發(fā)了測定棗中OA和UA含量的HPLC-MS定性定量分析方法，OA和UA的加標回收率分別為80.17%（RSD為954%）、95.93%（RSD為2.87%）。

3總結(jié)

天然產(chǎn)物中齊墩果酸和熊果酸的提取純化方法眾多，一般分為液相萃取和固相萃取兩大類，液相萃取方法簡便、價廉，缺點是耗時長、反應(yīng)條件不溫和，不符合當今“綠色化學(xué)”的主題；固相萃取優(yōu)點包括耗時短、有機溶劑使用量少，由于特定的固相吸附劑，得到的富集倍數(shù)更高，但對于大范圍中藥有效成分的富集提取不太適合?？偠灾?，2種方法各有所長。

而對于天然產(chǎn)物中齊墩果酸和熊果酸的分析方法而言，運用最為廣泛的是HPLC，色譜條件也較為成熟，不同檢測器得到的結(jié)果有些許差別，超高效液相色譜-三級四極桿質(zhì)譜法得到的結(jié)果最佳。

近年來，對于OA和UA藥效方面的研究層出不窮，而如何從各種天然產(chǎn)物中將這2種目標化合物提取分離出來，對于進一步的藥效學(xué)研究意義重大，該研究為含有OA和UA的天然產(chǎn)物的藥效研究提供試驗基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

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45卷19期徐 暢等天然產(chǎn)物中齊墩果酸和熊果酸提取和分析方法研究進展