張娜，張鵬，景明

（天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300384）

MTT法評(píng)價(jià)二甲基亞砜對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞增殖率的影響

張娜，張鵬，景明

（天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津300384）

為評(píng)價(jià)不同濃度二甲基亞砜（DMSO）對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）增殖率的影響，通過(guò)制備含3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%和0.5% 6個(gè)濃度DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液作為測(cè)試樣品與CHL細(xì)胞進(jìn)行接觸，進(jìn)行MTT試驗(yàn)。結(jié)果表明，各濃度測(cè)試樣品的細(xì)胞增殖率在40%-96%，由此說(shuō)明CHL細(xì)胞增殖率隨DMSO濃度的降低而增高，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

二甲基亞砜；倉(cāng)鼠；增殖

在傳統(tǒng)的醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，往往采用單一浸提介質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。而隨著醫(yī)療器械的發(fā)展，越來(lái)越多的新材料用于醫(yī)療器械設(shè)計(jì)制造，同時(shí)監(jiān)管制度也在逐步完善，因此需要采用更加多樣化的浸提介質(zhì)來(lái)對(duì)醫(yī)療器械的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)[1]。

DMSO由于同時(shí)具備極性和非極性溶劑的特點(diǎn)，被逐步應(yīng)用于醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)[2]。而高濃度的DMSO具有明確的細(xì)胞毒性作用。因此，將其應(yīng)用于醫(yī)療器械安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中的體外染色體畸變?cè)囼?yàn)前，需要選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試濃度，以保證染色體畸變?cè)囼?yàn)所用CHL細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

本文選用MTT法測(cè)定DMSO對(duì)CHL細(xì)胞的增殖率的影響。而在細(xì)胞增殖率測(cè)定試驗(yàn)中，MTT法是較為靈敏且被廣泛接受的一種浸提液檢測(cè)方法。該試驗(yàn)原理是哺乳動(dòng)物活細(xì)胞的線粒體酶可將外源性MTT降解形成藍(lán)紫色的物質(zhì)，而死細(xì)胞則無(wú)此功能，從而定量測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)增殖率[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞株

CHL細(xì)胞，由中國(guó)藥品生物制品鑒定所醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)樣品

DMSO，Merck公司提供。

1.3 試驗(yàn)樣品稀釋液制備

采用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基作為稀釋液，將DMSO樣品稀釋為3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%和0.5% 6個(gè)濃度。

1.4 試驗(yàn)分組

設(shè)立空白對(duì)照組，含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基；陰性對(duì)照，高密度聚乙烯浸提液，浸提介質(zhì)為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，浸提條件為（24±2）h；陽(yáng)性對(duì)照，5%DMSO。

1.5 試驗(yàn)方法

①將配制好的1×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種0.1mL。設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和各試驗(yàn)樣品浸提液組，每組6孔，置于5%CO2、（37±1）℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)（24±2）h后，棄去原培養(yǎng)液。各組加入相應(yīng)制備好的溶液，每孔0.1mL，于5% CO2、（37±1）℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)（72±2）h后，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入0.02mL質(zhì)量濃度5g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，再加入0.15mL DMSO，置振蕩器上振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（參比波長(zhǎng)為630nm），計(jì)算每組相對(duì)增殖率。②細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)判定：相對(duì)增殖率≥100%為0級(jí)，80%～99%為1級(jí)，50%～79%為2級(jí)，30%～49%為3級(jí)，0%～29%為4級(jí)。③試驗(yàn)成立條件：陰性對(duì)照組的反應(yīng)不大于1級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組至少為3級(jí)，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。④進(jìn)行4組平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

與細(xì)胞接觸72h，在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、1.0%、0.5%試驗(yàn)樣品組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，數(shù)量未見(jiàn)明顯減少；2.0%、1.5%試驗(yàn)樣品組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，數(shù)量明顯減少；3.0%、2.5%試驗(yàn)樣品組合陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞層完全破壞。

2.2 DMSO濃度對(duì)吸光值影響

DMSO濃度組對(duì)吸光值影響如表1所示。

2.3 DMSO濃度對(duì)增殖率影響

DMSO濃度組相對(duì)增殖率計(jì)算公式如下：RGR/%=供試品組各組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%。本試驗(yàn)陰性對(duì)照的相對(duì)增殖率為98%～99%，反應(yīng)分級(jí)均為0級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組增殖率為6%～8%，反應(yīng)分級(jí)均為4級(jí)，均符合試驗(yàn)成立條件，各組樣品結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2所示。

表1 各組試驗(yàn)結(jié)果（吸光度均值）

表2 每組相對(duì)增殖率

2.4 DMSO濃度與細(xì)胞增值率的關(guān)系

DMSO濃度變化與細(xì)胞增值率的關(guān)系如圖1所示。

圖1 DMSO濃度與細(xì)胞增殖率的關(guān)系

從圖1可見(jiàn)，DMSO濃度變化與細(xì)胞增值率關(guān)系呈線性關(guān)系。CHL細(xì)胞增殖率隨DMSO濃度的降低而增高，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

本文通過(guò)MTT法對(duì)6個(gè)濃度DMSO溶液對(duì)CHL細(xì)胞的增殖率影響進(jìn)行了4次平行試驗(yàn)。結(jié)果顯示：①CHL細(xì)胞增殖率隨DMSO濃度的降低而增高，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；②當(dāng)DMSO濃度為2.0%時(shí)，CHL細(xì)胞增殖率能夠達(dá)到50%以上，滿足遺傳毒性試驗(yàn)中染色體畸變?cè)囼?yàn)的相關(guān)要求。

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 16886.5-2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

[3]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

Effect of Two Methyl Sulfoxide on Proliferation Rate of Chinese Hamster Lung Fibroblast Cells by MTT

Zhang Na,Zhang Peng,Jing Ming
(Tianjin Medical Devices Quality Supervision and Testing Center,Tianjin 300384)

In order to evaluate the effects of different concentrations of two methyl sulfoxide (DMSO) on the proliferation of Chinese hamster lung fibroblasts (CHL),the cell culture medium containing 3.0%,2.5%,2.0%,1.5%,1.0% and 0.5% DMSO was prepared as the test sample,the test samples and CHL cells were exposed to carry out MTT test.The results showed that the cell proliferation rate of the samples was 40%-96%,which indicated that the proliferation rate of CHL cells was increased with the decrease of DMSO concentration,and there was a negative correlation between the proliferation rate of cells.

Two methyl sulfoxide;Hamster;Proliferation

R135.1

A

2096-0387（2017）03-0050-03

張娜（1987-），女，天津人，碩士，工程師，研究方向：醫(yī)療器械生物學(xué)安全評(píng)價(jià)。