趙一帆肖春陽冼磊

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科；2廣西醫(yī)科大學研究生院

臨床研究

肺腺癌組織中ANGPT1mRNA的表達及臨床意義

趙一帆1，2肖春陽2冼磊1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科；2廣西醫(yī)科大學研究生院

目的探討血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測ANGPT1 mRNA在51例肺腺癌（lung adenocarcinoma，LAC)組織及其相應癌旁正常組織和11例非腫瘤正常肺組織中的表達，分析ANGPT1mRNA表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的相對表達量為0.068±0.044，在相應癌旁正常組織中為0.696±0.157，在非腫瘤正常肺組織中為1.158±0.332，三者差異有統(tǒng)計學意義（F=114.34，P＜0.05）。ANGPT1 mRNA表達與肺腺癌患者年齡、性別、分化程度無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（P＜0.05)。結(jié)論ANGPT1 mRNA在肺腺癌組織中呈低表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期存在相關(guān)性，ANGPT1缺失可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

肺腫瘤；肺腺癌；血管生成素1；實時熒光定量PCR

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中大部分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），目前肺腺癌已超越鱗癌成為發(fā)病率最高的病理類型［1-2］。血管生成素1（angiopoietin-1，ANGPT1）是血管生成素家族中的一員，研究表明ANGPT1表達異常與喉癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤相關(guān)［3-4］。但ANGPT1與肺腺癌的相關(guān)研究較少，本研究通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測肺腺癌組織及其相應癌旁正常組織、非腫瘤正常肺組織中ANGPT1mRNA的表達，并分析其與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科2015年5月至2016年7月收治的肺腺癌手術(shù)切除癌組織51例及其相應癌旁正常組織，并收集非腫瘤正常肺組織（來自肺大皰、結(jié)核、支氣管擴張等）11例。所有組織均為患者確診活檢組織，經(jīng)病理學確診為肺腺癌或炎性組織。其中男性38例，女性13例。年齡37～78歲，平均年齡（57.74±10.18）歲。按TNM分期（第8版）標準玉期21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期9例，Ⅳ期3例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；低分化18例，中分化22例，高分化11例。癌組織取自原發(fā)灶，同時在距原發(fā)灶5 cm處取癌旁正常組織。標本獲取后立即放入無酶1.5 mL EP管中，液氮冷卻，置-80℃冰箱保存。所有患者均行外科手術(shù)治療，術(shù)前均未行放療和化療。本試驗通過廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

ABIStepone plus熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司，Nano Drop 2000分光光度計和5417R臺式冷凍高速離心機、-80℃低溫冰箱、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；AxyGen總RNA提取試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genebank人類ANGPT1、RPLPO基因cDNA序列，采用引物設(shè)計軟件Primer 5設(shè)計引物。ANGPT1引物由上海英濰捷基有限公司合成，RPLPO引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。ANGPT1引物序列：上游為5′-AGCGCCGAAGTCCAGAAAAC-3′，下游為5′-TACTCTCACGACAGTTGCCAT-3′；內(nèi)參RPLPO引物序列：上游為5′-CCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′，下游為5′-TCAGCAAGTGGGAAGGTGTA-ATC-3′。

1.4 實驗方法

提取組織中RNA，核酸蛋白測量儀檢測抽提RNA質(zhì)量和濃度，要求A260/A280在1.8～2.0之間，并計算RNA含量。按照逆轉(zhuǎn)錄盒說明書所示條件步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。合成的cDNA置于-20℃保存，同一時間進行實時熒光定量PCR檢測。以RPLPO為內(nèi)參，在ABIStepone plus熒光定量PCR儀上進行檢測。反應體系為20μL：SYBR Green Master 10μL、上下游引物各1μL、RNA-free H2O 6μL、cDNA模板2μL。反應條件：95℃預變性、15 min，95℃、變性10 s，60℃退火/延伸32 s，共40個循環(huán)。每個樣本均平行檢測3個孔。PCR結(jié)束后，按常規(guī)方法行瓊脂凝膠電泳，檢測擴增出的PCR產(chǎn)物。得到數(shù)據(jù)采用2-△△Ct計算。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗；ANGPT1mRNA在肺腺癌組織及其相應癌旁正常組織和非腫瘤正常肺組織中的表達差異采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肺組織中ANGPT1mRNA的表達

ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的相對表達量為0.068±0.044，在相應癌旁正常組織中為0.696±0.157，在非腫瘤正常肺組織中為1.158±0.332，三者差異有統(tǒng)計學意義（F=114.34，P＜0.05）。見圖1。ANGPT1 PCR產(chǎn)物長度大概為150 bp，內(nèi)參RPLPO PCR產(chǎn)物長度大概為100 bp，與生物數(shù)據(jù)庫長度大致相等，說明所得產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。見圖2。

圖1 ANGPT1 mRNA在不同肺組織中的表達

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂電泳圖

2.2 肺腺癌中ANGPT1mRNA的表達與臨床病理特征的關(guān)系

ANGPT1mRNA表達與患者性別、年齡、分化程度均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，玉+Ⅱ期、無淋巴轉(zhuǎn)移患者ANGPT1 mRNA表達量明顯高于 Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.001）。見表1。

表1 肺腺癌組織中ANGPT1 mRNA的表達與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 肺腺癌組織中ANGPT1 mRNA的表達與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理特征 n ANGPT1 mRNA表達量 t P性別 1.160 0.264男38 0.145±0.054女13 0.175±0.086年齡（歲） 1.607 0.118＜60 29 0.140±0.048≥60 22 0.170±0.079分化程度 1.655 0.105中分化+高分化 33 0.163±0.070低分化 18 0.135±0.050 TNM分期 4.666 ＜0.001玉+Ⅱ期 39 0.201±0.084Ⅲ+Ⅳ期 12 0.084±0.034淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 15.841＜0.001無23 0.226±0.054有28 0.032±0.032

3 討論

肺癌發(fā)病率和致死率在所有惡性腫瘤中位列首位［1］，新增病例中近一半來自亞洲，而其中大部分來自中國。肺癌分為NSCLC和小細胞肺癌兩大類，其中超過八成的肺癌為NSCLC，腺癌已經(jīng)成為我國肺癌最常見的病理類型［2］。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的復雜病理過程，在生長、轉(zhuǎn)移過程中均需要豐富的血液供應。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與有效的血管形成密切相關(guān)，較高的微血管密度不僅與更高的腫瘤分期及早期復發(fā)有關(guān)，也與較高的腫瘤轉(zhuǎn)移率及較短的無瘤生存期有關(guān)［5］。

血管生成素（angiopoietin，ANGPT）-TIE信號系統(tǒng)是獨立于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以外且在腫瘤血管形成中有重要意義的一個系統(tǒng)。ANGPT-TIE系統(tǒng)主要包括其配體ANGPT及受體 TIE（Tie1和Tie2），ANGPT又包括ANGPT1、ANGPT2、ANGPT3和 ANGPT4。ANGPT1是Tie2的激動劑，ANGPT2是ANGPT1的拮抗劑［6］。ANGPT1主要在周細胞、成纖維細胞及非血管性細胞中表達，分泌的糖蛋白通過誘導內(nèi)皮細胞酪氨酸磷酸化激活受體而在血管發(fā)育和生成方面起重要作用［7］。現(xiàn)有研究表明ANGPT1異常表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。但有關(guān)ANGPT1蛋白在腫瘤組織中的表達研究結(jié)果并不一致。趙磊等［8］采用免疫組化法檢測ANGPT1在結(jié)直腸癌組織中的表達，結(jié)果顯示在癌組織中陽性表達率為80.8%。Naumnik等［9］研究發(fā)現(xiàn)與正常人相比，NSCLC患者血清以及肺泡灌洗液中ANGPT1含量均增高。但王強［10］采用免疫組化法檢測54例胃腺癌組織，發(fā)現(xiàn)ANGPT1在癌組織中低表達。本研究采用qRT-PCR法檢測51例肺腺癌組織及其相應癌旁正常組織和11例非腫瘤正常肺組織中ANGPT1mRNA的表達，結(jié)果顯示ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中呈低表達狀態(tài)，在相應癌旁正常組織中的表達量是肺腺癌組織的10.19倍，在非腫瘤正常肺組織中的表達量是癌旁組織的1.66倍，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步分析ANGPT1mRNA表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ANGPT1 mRNA表達在晚期、轉(zhuǎn)移患者中的表達量明顯低于早期、無轉(zhuǎn)移患者，提示ANGPT1低表達可能對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有促進作用。吳平等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ANGPT1表達異常，可能通過參與腫瘤微淋巴管形成促進其轉(zhuǎn)移，并可作為預測發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險因子及抗淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點，但對于ANGPT1影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的認識目前尚未統(tǒng)一［12-13］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ANGPT1mRNA在肺腺癌組織中的表達低于正常組織，并與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為肺癌治療的一個潛在靶點，但具體作用機制需進一步研究加以闡明。

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［2017-02-24收稿］［2017-03-28修回］［編輯 羅惠予］

Expression and clinical significance of angiopoietin-1mRNA in lung adenocarcinoma

Zhao Yifan2，Xiao Chunyang2，Xian Lei1（1Department of Thoracic Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital Guangxi Medical University；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Xian Lei.E-mail：xianlei59@163.com

Objective To observe changes in angiopoietin-1（ANGPT1）expression in lung adenocarcinoma and investigate the potential clinical significance.Methods A total of 51 cancer tissue samples and adjacent normal tissues were collected from lung adenocarcinoma patients；in addition，11 non-cancer normal tissues were collected.Relative levels of ANGPT1 mRNA were assessed using quantitative real-time PCR，and possible relationships between ANGPT1 mRNA and clinicopathology were explored.Results Relative levels of ANGPT1 mRNA were 0.068±0.044 in lung adenocarcinoma tissue，0.696±0.157 in adjacent normal tissue，and 1.158±0.332 in non-cancer normal tissue（F=114.34，P＜0.05）.Levels of ANGPT1 mRNA in lung adenocarcinoma tissues were not related to gender，age，or degree of differentiation（P＞0.05），but they were related to TNM stage and lymphatic metastasis（P＜0.05）. Conclusion ANGPT1 expression is reduced in lung adenocarcinoma，whichmay be involved in disease onsetand development.

Lung neoplasms；Lung adenocarcinoma；Angiopoietin-1；Quantitative real-time PCR

R734.2

A

1674-5671（2017）02-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.02.11

廣西自然科學基金資助項目（2013GXNSFAA019270）；廣西壯族自治區(qū)教育廳高?？蒲匈Y助項目（YB2014060）

冼磊。E-mail：xianlei59@163.com