史嘉林

摘 要：隨著生物技術(shù)的發(fā)展，用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白得到了快速發(fā)展。這種技術(shù)集合了微生物發(fā)酵速度快、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物種類(lèi)多等優(yōu)點(diǎn)，也因此在近幾年這類(lèi)技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注。本文就用植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)重組的優(yōu)勢(shì)、原則、現(xiàn)狀等問(wèn)題對(duì)植物細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白做簡(jiǎn)單的論述。

關(guān)鍵詞：植物細(xì)胞；培養(yǎng)生產(chǎn)；重組蛋白

20世紀(jì)初植物細(xì)胞的培養(yǎng)開(kāi)始受到關(guān)注，之后的30年植物細(xì)胞培養(yǎng)得到了快速的發(fā)展，其中包括植物器官的組織、原生質(zhì)體以及植株的培養(yǎng)等。植物細(xì)胞的培養(yǎng)主要應(yīng)用在快速繁殖、有用物質(zhì)的生產(chǎn)、和植物細(xì)胞的遺傳等方面。但植物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在培養(yǎng)重組蛋白的生產(chǎn)方面確是在近20年才發(fā)展來(lái)的。

1 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白的原則

1.1 選擇宿主細(xì)胞

發(fā)根、固定細(xì)胞、腫瘤狀物以及懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)是植物細(xì)胞培養(yǎng)的主要方法，現(xiàn)在選擇宿主細(xì)胞主要從擬南芥、煙草、紫衫、番茄、水稻和大豆等作物中進(jìn)行選擇。但是研究表示：番茄、水稻、大豆本身可以用來(lái)食用、有良好的可調(diào)控性，表達(dá)水平也比較高而且能有效的分泌蛋白[1]。因此，即便煙草中含有的細(xì)胞更容易繁殖和生長(zhǎng)但仍沒(méi)有可作為食物來(lái)用的水稻、大豆和番茄等作物更適合宿主細(xì)胞。

1.2 構(gòu)建重組蛋白

構(gòu)建重組蛋白在植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中也占據(jù)了非常重要的位置，它能夠決定重組蛋白的產(chǎn)量，因此在構(gòu)建重組蛋白時(shí)一定要注意兩點(diǎn)：一點(diǎn)是構(gòu)建前導(dǎo)肽，另一點(diǎn)是選擇啟動(dòng)子。首先，前導(dǎo)肽的好壞對(duì)重組蛋白的分泌有直接的影響，比如說(shuō)：如果蛋白質(zhì)的分子量不能達(dá)到30kDa，那么這種蛋白質(zhì)在一般情況下都會(huì)分泌在植物懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液中。反之，某些大分子量的蛋白質(zhì)則會(huì)留在細(xì)胞內(nèi)。其次，啟動(dòng)子對(duì)重組蛋白的產(chǎn)量也有很大的影響。因?yàn)椋瑔?dòng)子能夠決定轉(zhuǎn)錄水平的高低，而轉(zhuǎn)錄水平又對(duì)重組蛋白的產(chǎn)量有很大的影響，因此啟動(dòng)子的好壞能夠決定重組蛋白的產(chǎn)量的多少。

1.3 植物懸浮細(xì)胞

植物懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相差非常的大，并且它們是生長(zhǎng)曲線(xiàn)也完全不一樣，但這并不代表植物懸浮細(xì)胞不可以用生物細(xì)胞的生長(zhǎng)方式進(jìn)行繁殖，相反植物懸浮細(xì)胞仍可以按照生物發(fā)酵的方式進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。在1992年Nagata的報(bào)道中，煙草細(xì)胞的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)速率是0.044/小時(shí)，此外，植物細(xì)胞培養(yǎng)速率與細(xì)菌的攝氧速率有很大的差距，但是當(dāng)傳統(tǒng)的發(fā)酵方式經(jīng)過(guò)了修改整理之后，植物懸浮細(xì)胞就又能夠通過(guò)發(fā)酵的方式進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖了。

2 重組蛋白的分離提純

每種生物制品在生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中都不能缺少下游過(guò)程，所謂的下游過(guò)程就是將重組蛋白進(jìn)行進(jìn)行分離和提純的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程對(duì)于重組細(xì)胞的產(chǎn)量來(lái)講有著極為重要的作用。蛋白質(zhì)的分離提純過(guò)程是一種同中有異的過(guò)程，因?yàn)殡m然每一種蛋白都有自己獨(dú)特的分離提純過(guò)程，但在這些看似毫不相同的過(guò)程當(dāng)中仍然有一些相同的標(biāo)準(zhǔn)和步驟是一致的。比如說(shuō)：在臨床的應(yīng)用過(guò)程中對(duì)重組蛋白有很高的要求，但是如果重組蛋白用于一般的用處，則對(duì)它的要求就不會(huì)像對(duì)臨床應(yīng)用的一樣高。一般的重組蛋白在分離純化時(shí)有以下幾種方法：

首先，要確定植物細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，然后用分層技術(shù)分離提純目的蛋白。這個(gè)過(guò)程的出產(chǎn)物體積相對(duì)來(lái)講比較大，所以如果能夠用層析技術(shù)來(lái)提純所需要的蛋白，那么產(chǎn)物就會(huì)被盡可能的壓縮[2]。這是在重組蛋白是分泌蛋白的情況下，那么如果重組蛋白是胞內(nèi)蛋白呢？當(dāng)重組蛋白是胞內(nèi)蛋白時(shí)，它與重組蛋白是分泌蛋白的分離過(guò)程和相近。先經(jīng)過(guò)過(guò)濾將懸浮細(xì)胞過(guò)濾出來(lái)，然后將細(xì)胞壁和細(xì)胞核進(jìn)行破碎處理，緊接著是抽提，最后運(yùn)用層析技術(shù)對(duì)目的蛋白提純。

3 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白存在的問(wèn)題

3.1 生產(chǎn)時(shí)重組蛋白不穩(wěn)定

重組蛋白穩(wěn)定與否對(duì)于植物細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程來(lái)講有著極為重要的作用，但在植物細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中重組蛋白的穩(wěn)定性問(wèn)題卻是一個(gè)難度非常大的課題。也因此到目前為止，能夠符合GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的宿主細(xì)胞株的特性庫(kù)仍然沒(méi)有被研發(fā)出來(lái)。建立宿主細(xì)胞株特性庫(kù)是在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中不可或缺的一項(xiàng)重要因素，原因是生產(chǎn)的起始原料與生產(chǎn)過(guò)程的具體路線(xiàn)是由它所限定的，除此之外重組蛋白是否能達(dá)到一致性和穩(wěn)定性也由它所決定。因此重組蛋白的穩(wěn)定性對(duì)于植物細(xì)胞的生產(chǎn)和培養(yǎng)有著很大的作用。

3.2 外源基因逃逸現(xiàn)象

植物基因組的DNA和穩(wěn)定整合在植物基因組里的外源DNA基本上一塊參與了所有的遺傳學(xué)行為，所以，這些外源DNA在很大程度上有隨著植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程引起基因的沉默或是向環(huán)境中漂移的可能性。當(dāng)外源基因沉默或是漂移之后，目的重組蛋白的產(chǎn)量就會(huì)隨之下降。

4 用植物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)重組的益處

植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白集合了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵以及完整植株培養(yǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。植物懸浮細(xì)胞可以在不需要特殊處理的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)也可以合成復(fù)雜的糖蛋白和多聚體蛋白，比如：白細(xì)胞介素與免疫球蛋白，它們不僅不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素而且也不會(huì)攜帶人類(lèi)的病原菌；不僅如此，它還可以像完整植株的培養(yǎng)系統(tǒng)一樣進(jìn)行翻譯后的糖基化以及轉(zhuǎn)入后的修飾。據(jù)2004年Gomord的報(bào)道：植物蛋白培養(yǎng)的重組人體糖蛋白比用其他物質(zhì)合成的重組人體糖蛋白更相似于天然人體糖蛋白。而且，植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白不會(huì)受到土壤、氣候以及季節(jié)等因素的影響，更重要的是，當(dāng)目的重組蛋白能夠分泌在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中時(shí)，它還具有簡(jiǎn)單易行的產(chǎn)物分離提純過(guò)程。

5 小結(jié)

隨著生物技術(shù)以及基因工程的飛速發(fā)展，植物細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)重組蛋白得到了越累越多專(zhuān)業(yè)人士的重視。但是怎樣按照GMP的要求建立起宿主細(xì)胞的特性庫(kù)以及怎樣解決植物細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的一系列問(wèn)題對(duì)于現(xiàn)如今的生物學(xué)界來(lái)講仍然是一些難以解決但又急需得到突破的一些問(wèn)題。用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白這一課題想要得到質(zhì)的飛躍，那么生物界現(xiàn)如今面臨的問(wèn)題不僅要解決還要有進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)

[1]張曉勇，王海林，高向陽(yáng)，等.植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白[N].生物技術(shù)通報(bào)，2015，（6）：43-45.

[2]孫國(guó)鳳.用植物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白[N].生物技術(shù)通報(bào)，2013，（1）：8-9.

（作者單位：哈藥集團(tuán)生物工程有限公司原液車(chē)間真核工段）