史嘉林

摘 要：隨著生物技術(shù)的發(fā)展，用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白得到了快速發(fā)展。這種技術(shù)集合了微生物發(fā)酵速度快、動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物種類多等優(yōu)點，也因此在近幾年這類技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注。本文就用植物細胞進行培養(yǎng)重組的優(yōu)勢、原則、現(xiàn)狀等問題對植物細胞的培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白做簡單的論述。

關(guān)鍵詞：植物細胞；培養(yǎng)生產(chǎn)；重組蛋白

20世紀初植物細胞的培養(yǎng)開始受到關(guān)注，之后的30年植物細胞培養(yǎng)得到了快速的發(fā)展，其中包括植物器官的組織、原生質(zhì)體以及植株的培養(yǎng)等。植物細胞的培養(yǎng)主要應(yīng)用在快速繁殖、有用物質(zhì)的生產(chǎn)、和植物細胞的遺傳等方面。但植物細胞的培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在培養(yǎng)重組蛋白的生產(chǎn)方面確是在近20年才發(fā)展來的。

1 植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白的原則

1.1 選擇宿主細胞

發(fā)根、固定細胞、腫瘤狀物以及懸浮細胞的培養(yǎng)是植物細胞培養(yǎng)的主要方法，現(xiàn)在選擇宿主細胞主要從擬南芥、煙草、紫衫、番茄、水稻和大豆等作物中進行選擇。但是研究表示：番茄、水稻、大豆本身可以用來食用、有良好的可調(diào)控性，表達水平也比較高而且能有效的分泌蛋白[1]。因此，即便煙草中含有的細胞更容易繁殖和生長但仍沒有可作為食物來用的水稻、大豆和番茄等作物更適合宿主細胞。

1.2 構(gòu)建重組蛋白

構(gòu)建重組蛋白在植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中也占據(jù)了非常重要的位置，它能夠決定重組蛋白的產(chǎn)量，因此在構(gòu)建重組蛋白時一定要注意兩點：一點是構(gòu)建前導(dǎo)肽，另一點是選擇啟動子。首先，前導(dǎo)肽的好壞對重組蛋白的分泌有直接的影響，比如說：如果蛋白質(zhì)的分子量不能達到30kDa，那么這種蛋白質(zhì)在一般情況下都會分泌在植物懸浮細胞的培養(yǎng)液中。反之，某些大分子量的蛋白質(zhì)則會留在細胞內(nèi)。其次，啟動子對重組蛋白的產(chǎn)量也有很大的影響。因為，啟動子能夠決定轉(zhuǎn)錄水平的高低，而轉(zhuǎn)錄水平又對重組蛋白的產(chǎn)量有很大的影響，因此啟動子的好壞能夠決定重組蛋白的產(chǎn)量的多少。

1.3 植物懸浮細胞

植物懸浮細胞的生長速率和生物細胞的生長速率相差非常的大，并且它們是生長曲線也完全不一樣，但這并不代表植物懸浮細胞不可以用生物細胞的生長方式進行繁殖，相反植物懸浮細胞仍可以按照生物發(fā)酵的方式進行生長繁殖。在1992年Nagata的報道中，煙草細胞的懸浮細胞生長速率是0.044/小時，此外，植物細胞培養(yǎng)速率與細菌的攝氧速率有很大的差距，但是當(dāng)傳統(tǒng)的發(fā)酵方式經(jīng)過了修改整理之后，植物懸浮細胞就又能夠通過發(fā)酵的方式進行生長和繁殖了。

2 重組蛋白的分離提純

每種生物制品在生產(chǎn)過程當(dāng)中都不能缺少下游過程，所謂的下游過程就是將重組蛋白進行進行分離和提純的過程，這個過程對于重組細胞的產(chǎn)量來講有著極為重要的作用。蛋白質(zhì)的分離提純過程是一種同中有異的過程，因為雖然每一種蛋白都有自己獨特的分離提純過程，但在這些看似毫不相同的過程當(dāng)中仍然有一些相同的標(biāo)準(zhǔn)和步驟是一致的。比如說：在臨床的應(yīng)用過程中對重組蛋白有很高的要求，但是如果重組蛋白用于一般的用處，則對它的要求就不會像對臨床應(yīng)用的一樣高。一般的重組蛋白在分離純化時有以下幾種方法：

首先，要確定植物細胞的生長曲線，然后用分層技術(shù)分離提純目的蛋白。這個過程的出產(chǎn)物體積相對來講比較大，所以如果能夠用層析技術(shù)來提純所需要的蛋白，那么產(chǎn)物就會被盡可能的壓縮[2]。這是在重組蛋白是分泌蛋白的情況下，那么如果重組蛋白是胞內(nèi)蛋白呢？當(dāng)重組蛋白是胞內(nèi)蛋白時，它與重組蛋白是分泌蛋白的分離過程和相近。先經(jīng)過過濾將懸浮細胞過濾出來，然后將細胞壁和細胞核進行破碎處理，緊接著是抽提，最后運用層析技術(shù)對目的蛋白提純。

3 植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白存在的問題

3.1 生產(chǎn)時重組蛋白不穩(wěn)定

重組蛋白穩(wěn)定與否對于植物細胞的培養(yǎng)生產(chǎn)過程來講有著極為重要的作用，但在植物細胞的培養(yǎng)生產(chǎn)過程當(dāng)中重組蛋白的穩(wěn)定性問題卻是一個難度非常大的課題。也因此到目前為止，能夠符合GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的宿主細胞株的特性庫仍然沒有被研發(fā)出來。建立宿主細胞株特性庫是在工業(yè)生產(chǎn)過程當(dāng)中不可或缺的一項重要因素，原因是生產(chǎn)的起始原料與生產(chǎn)過程的具體路線是由它所限定的，除此之外重組蛋白是否能達到一致性和穩(wěn)定性也由它所決定。因此重組蛋白的穩(wěn)定性對于植物細胞的生產(chǎn)和培養(yǎng)有著很大的作用。

3.2 外源基因逃逸現(xiàn)象

植物基因組的DNA和穩(wěn)定整合在植物基因組里的外源DNA基本上一塊參與了所有的遺傳學(xué)行為，所以，這些外源DNA在很大程度上有隨著植物細胞培養(yǎng)過程引起基因的沉默或是向環(huán)境中漂移的可能性。當(dāng)外源基因沉默或是漂移之后，目的重組蛋白的產(chǎn)量就會隨之下降。

4 用植物細胞進行培養(yǎng)重組的益處

植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白集合了動物細胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵以及完整植株培養(yǎng)等諸多優(yōu)點。植物懸浮細胞可以在不需要特殊處理的培養(yǎng)基中生長也可以合成復(fù)雜的糖蛋白和多聚體蛋白，比如：白細胞介素與免疫球蛋白，它們不僅不會產(chǎn)生內(nèi)毒素而且也不會攜帶人類的病原菌；不僅如此，它還可以像完整植株的培養(yǎng)系統(tǒng)一樣進行翻譯后的糖基化以及轉(zhuǎn)入后的修飾。據(jù)2004年Gomord的報道：植物蛋白培養(yǎng)的重組人體糖蛋白比用其他物質(zhì)合成的重組人體糖蛋白更相似于天然人體糖蛋白。而且，植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白不會受到土壤、氣候以及季節(jié)等因素的影響，更重要的是，當(dāng)目的重組蛋白能夠分泌在懸浮細胞培養(yǎng)液中時，它還具有簡單易行的產(chǎn)物分離提純過程。

5 小結(jié)

隨著生物技術(shù)以及基因工程的飛速發(fā)展，植物細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)重組蛋白得到了越累越多專業(yè)人士的重視。但是怎樣按照GMP的要求建立起宿主細胞的特性庫以及怎樣解決植物細胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的一系列問題對于現(xiàn)如今的生物學(xué)界來講仍然是一些難以解決但又急需得到突破的一些問題。用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白這一課題想要得到質(zhì)的飛躍，那么生物界現(xiàn)如今面臨的問題不僅要解決還要有進展。

參考文獻

[1]張曉勇，王海林，高向陽，等.植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白[N].生物技術(shù)通報，2015，（6）：43-45.

[2]孫國鳳.用植物細胞生產(chǎn)重組蛋白[N].生物技術(shù)通報，2013，（1）：8-9.

（作者單位：哈藥集團生物工程有限公司原液車間真核工段）