張 旗，孫 迎，杜星志，鄧代進(jìn)，楊勝波

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

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技術(shù)與方法

改良Sihler's神經(jīng)染色法顯示股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)分布

張 旗1，孫 迎1，杜星志1，鄧代進(jìn)1，楊勝波2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 構(gòu)建肉眼可見的股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式。方法 緊貼脂肪表面取下6具12側(cè)甲醛固定的中國成年尸體股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚。無水乙醇脫脂3d，膠原酶和胰酶消化3 d后，改良的Sihler’s神經(jīng)染色法染色皮膚內(nèi)神經(jīng)。Photoshop軟件測數(shù)神經(jīng)纖維密度。結(jié)果 運(yùn)用改良的Sihler’s神經(jīng)染色法染色皮膚，肉眼即可觀察到皮下和真皮內(nèi)神經(jīng)次級分支。真皮內(nèi)可見神經(jīng)扭曲與打結(jié)走行，神經(jīng)分支間存在吻合。股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)、中間及內(nèi)側(cè)部的上、中、下1/3區(qū)神經(jīng)密度分別為(0.90±0.31、1.46±0.67、1.84±0.67、1.66±0.79、2.77±0.77、2.60±0.78、3.86±1.10、4.99±1.38、6.65±1.39)根/cm2。即外側(cè)部上1/3區(qū)最稀疏，內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)最密集。結(jié)論 改良的Sihler's神經(jīng)染色法能清晰顯示肉眼可見的股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)；這些結(jié)果為皮瓣移植感覺重建選材匹配和提高皮膚活檢成功率提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

Sihler’s神經(jīng)染色法；股前內(nèi)側(cè)區(qū)；神經(jīng)分布；皮膚；人

許多組織學(xué)技術(shù)已顯示了皮膚各層內(nèi)的神經(jīng)纖維并測數(shù)了神經(jīng)纖維密度，但局限于切片內(nèi)觀察[1-3]。尚缺乏一種通過肉眼即可整體觀察到皮膚內(nèi)細(xì)小神經(jīng)分布的形態(tài)學(xué)證據(jù)。然而，Sihler’s染色法能清晰地顯示肉眼可見的肌內(nèi)神經(jīng)分布模式[4]，但在本研究的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該方法卻難以讓皮膚透明。皮膚中富含膠原纖維[5-6]，是否為皮膚無法透明的原因，目前尚不清楚。有資料表明，股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)部皮膚，常作為萬能移植皮瓣和活檢診斷周圍神經(jīng)病的供體[7-8]。針對這大面積的區(qū)域，到底何處取材效果最好，有待研究。因此，本研究擬改良Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法，顯示肉眼可見的皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式，測數(shù)其神經(jīng)密度，旨在為填補(bǔ)人股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式的解剖學(xué)資料、皮瓣移植感覺重建的選材匹配及提高皮膚活檢成功率等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與大體解剖 選取來自遵義醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室教學(xué)用過的無神經(jīng)疾病、皮膚疾病及糖尿病史的經(jīng)甲醛固定過的30～65歲中國成年人尸體6具(男4，女2)，按照局部解剖學(xué)界定的股前內(nèi)側(cè)區(qū)，緊貼肌表面取下兩側(cè)股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚，觀察神經(jīng)來源后盡力剔除脂肪，不損傷皮膚。游標(biāo)卡尺測量股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)、中間及內(nèi)側(cè)部的上、中、下1/3區(qū)的皮膚長度，寬度和厚度。

1.2 改良Sihler's神經(jīng)染色法顯示皮膚內(nèi)神經(jīng) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中積累的經(jīng)驗(yàn)，皮下脂肪厚的比薄的皮膚更難透明；用膠原酶和胰酶消化處理富含膠原的皮膚后更易透明；加大過氧化氫濃度可增加皮膚漂白程度[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)需要重點(diǎn)改良浸解除色素這一步，關(guān)鍵是讓皮膚透明或者半透明。①浸解除色素：先將取下的皮膚經(jīng)無水乙醇脫脂3 d，0.25%膠原酶和0.25%胰酶消化3 d后，再進(jìn)入Sihler's肌內(nèi)神經(jīng)染色法流程：為了漂白皮膚，將Sihler's染色法中0.2%的過氧化氫濃度提升5倍，即1%，3%的氫氧化鉀溶液提升到4%～5%，浸解時(shí)間從原來的4周延長至5周，當(dāng)肉眼觀察皮膚全為白色時(shí)，將其置于X光閱片燈上，能看透皮膚即為理想的除色素；②脫鈣：置入Sihler’s Ⅰ溶液(1份冰醋酸、2份甘油、12份1%水合三氯乙醛)中脫鈣，從原來的4周延長至5周，直至輕度皺縮的皮膚重新透明；③染色：Sihler’s Ⅱ溶液(1份Ehrlich蘇木素液、2份甘油、12份1%水合三氯乙醛)染色4周；④脫色：重新置入Sihler’s Ⅰ溶液進(jìn)行脫色8～24 h；⑤中和：0.05%碳酸鋰溶液中浸泡1～3 h。⑥透明：40%、60%、80%、100%梯度甘油中1周；⑦X光閱片箱上肉眼觀察皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式并繪制模式圖；⑧因皮膚在脫鈣過程中會輕度皺縮，用游標(biāo)卡尺重新測量皮膚長度和寬度，計(jì)算皮膚縮放系數(shù)：染色后皮膚面積÷染色前皮膚面積；⑨由于整塊皮膚面積大，照相時(shí)難以捕捉到細(xì)小的神經(jīng)，在染色標(biāo)本上放置橫向與縱向兩個(gè)直尺，橫向和縱向各放2根釣魚線，將皮膚標(biāo)本分成外側(cè)、中間、內(nèi)側(cè)3部，每部進(jìn)一步分為上、中、下3個(gè)區(qū)域，整塊皮膚共分為9個(gè)區(qū)，微距下照相，再將9張照片組合在一起。

1.3 計(jì)數(shù)皮膚內(nèi)神經(jīng)分支密度 在Adobe PhotoShop 13.0軟件下，打開原圖，根據(jù)圖片中直尺上的刻度，利用縱向和橫向參考線工具，設(shè)置2 cm×2 cm大小的矩形框，從上向下，從左向右拖動(dòng)參考線，計(jì)數(shù)各個(gè)部位皮膚內(nèi)次級神經(jīng)分支(真皮內(nèi))的根數(shù)[3,8]，一旦神經(jīng)分支有跨越其它矩形框時(shí)，不再重復(fù)計(jì)數(shù)。不是矩形區(qū)域，用割補(bǔ)法計(jì)算皮膚面積和計(jì)數(shù)神經(jīng)根數(shù)。神經(jīng)總根數(shù)÷區(qū)域皮膚面積=區(qū)域內(nèi)神經(jīng)纖維密度；區(qū)域內(nèi)神經(jīng)纖維密度×縮放系數(shù)=校正后區(qū)域內(nèi)神經(jīng)纖維密度。

2 結(jié)果

2.1 大體解剖觀察及測量 觀察到股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚的神經(jīng)支配除了來自大的皮神經(jīng)干外，大腿前外側(cè)下部、前中部，以及前內(nèi)側(cè)下部均有穿過肌肉后來的細(xì)小分支。股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚總面積為(688.89±36.56)cm2，平均厚度為(0.19±0.03)cm。股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)、中間及內(nèi)側(cè)部的上、中、下1/3區(qū)的皮膚面積和厚度見表1。中間部中1/3區(qū)面積最大，外側(cè)部下1/3區(qū)最??；外側(cè)部上1/3區(qū)最厚，內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)最薄。

2.2 改良Sihler's染色法染皮膚內(nèi)神經(jīng)所見 改良Sihler's染色法后，皮膚組織呈淡紫色，輕度皺縮，測得染色后與染色前皮膚面積的縮放系數(shù)為0.80±0.01，即縮減了20%。X線閱片燈上可透過皮膚肉眼見到真皮內(nèi)的神經(jīng)次級分支著為黑色，多數(shù)次級分支進(jìn)一步樹枝樣分支，有的神經(jīng)支走行扭曲，甚至打結(jié)，越來越細(xì)的神經(jīng)支之間可見“Y”型，“U型”或“O”型吻合(圖1～4)。由于解剖中剔除皮下脂肪時(shí)，部分皮下脂肪難以剔除干凈，故肉眼也可見部分皮下脂肪內(nèi)神經(jīng)細(xì)支。染色的浸解過程中表皮常常脫落，即使不脫落，平鋪的皮膚上也不能分界表皮與真皮，不能看見表皮內(nèi)神經(jīng)分支，但可見部分皮下脂肪和真皮內(nèi)神經(jīng)分布不均勻(圖1～4)。

藍(lán)色箭頭指向皮膚內(nèi)扭曲與打結(jié)走行的神經(jīng)次級分支，標(biāo)尺2.9cm。圖1 改良的Sihler's染色法顯示肉眼可見的股前內(nèi)側(cè)區(qū)中間部中1/3區(qū)局部皮膚內(nèi)神經(jīng)分布

A=股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)部上1/3區(qū)、B=外側(cè)部中1/3區(qū)、C=外側(cè)部下1/3區(qū)；D=中間部上1/3區(qū)、E=中間部中1/3區(qū)、F=中間部下1/3區(qū)；G=內(nèi)側(cè)部上1/3區(qū)、H=內(nèi)側(cè)部中1/3區(qū)、I=內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)。 圖2 左側(cè)股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)分布分區(qū)圖

為了清晰顯示實(shí)物圖中細(xì)小的神經(jīng)分支，圖A～I(xiàn)中的紅色方框區(qū)會特寫在圖4中。 圖3 左側(cè)股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式圖

藍(lán)色箭頭指向皮膚中扭曲與打結(jié)走行的次級神經(jīng)分支。標(biāo)尺1.4 cm。 圖4 左側(cè)股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚神經(jīng)分布模式圖9個(gè)區(qū)域內(nèi)相應(yīng)紅方框的局部特寫

2.3 股前內(nèi)側(cè)區(qū)各小區(qū)域神經(jīng)纖維密度 股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)、中間及內(nèi)側(cè)部的上、中、下1/3區(qū)的神經(jīng)纖維密度如表1所示，各區(qū)域間的比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)最密集，外側(cè)部上1/3區(qū)最稀疏。各部各區(qū)域間密度大小依次為：內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)>內(nèi)側(cè)部中1/3區(qū)>內(nèi)側(cè)部上1/3區(qū)>中間部中1/3區(qū)>中間部下1/3區(qū)>外側(cè)部下1/3區(qū)>中間部上1/3區(qū)>外側(cè)部中1/3區(qū)>外側(cè)部上1/3。左、右側(cè)股前內(nèi)側(cè)區(qū)神經(jīng)纖維密度比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 股前內(nèi)側(cè)區(qū)9個(gè)小區(qū)域皮膚面積、厚度和真皮內(nèi)神經(jīng)密度

區(qū)域面積(cm2)皮膚厚度(cm)實(shí)測神經(jīng)密度(根/cm2)校正后神經(jīng)密度(根/cm2)外側(cè)部上1/3區(qū)52.36±4.210.25±0.021.13±0.400.90±0.31外側(cè)部中1/3區(qū)89.91±7.660.19±0.041.82±0.841.46±0.67外側(cè)部下1/3區(qū)17.24±1.280.21±0.042.30±1.301.84±0.67中間部上1/3區(qū)81.25±6.530.17±0.262.20±0.991.66±0.79中間部中1/3區(qū)126.11±10.270.18±0.033.46±0.962.77±0.77中間部下1/3區(qū)85.52±6.790.17±0.243.25±0.982.60±0.78內(nèi)側(cè)部上1/3區(qū)94.29±8.380.24±0.044.82±1.373.86±1.10內(nèi)側(cè)部中1/3區(qū)125.01±9.870.19±0.026.22±1.734.99±1.38內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)81.45±6.710.17±0.038.31±1.746.65±1.39

3 討論

皮膚的神經(jīng)支配密集，其機(jī)械和傷害性感受器感受的神經(jīng)沖動(dòng)由位于三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的周圍突傳至大腦。周圍突終止于皮膚前，在皮下或肌筋膜間隙內(nèi)形成粗細(xì)不等的皮神經(jīng)，沿途樹枝樣分支[10]。神經(jīng)進(jìn)入皮膚后的細(xì)小分支，許多技術(shù)從組織學(xué)層面進(jìn)行了證實(shí)，并作了神經(jīng)纖維密度計(jì)數(shù)[1-3，11]，但這些研究僅局限于切片上觀察，未能整體顯示肉眼可見的皮膚內(nèi)神經(jīng)分布。

近十多年來，本實(shí)驗(yàn)室一直在應(yīng)用Sihler’s染色法著色神經(jīng)纖維髓鞘而清晰顯示整肌內(nèi)神經(jīng)分布模式[12-14]，并寄希望該方法能清晰顯示整塊皮膚內(nèi)神經(jīng)分布，但前期實(shí)驗(yàn)中該方法不能讓皮膚透明，筆者們考慮為皮下脂肪和皮膚內(nèi)豐富的膠原影響了實(shí)驗(yàn)效果，本實(shí)驗(yàn)中便采用無水乙醇脫脂3 d，膠原酶和胰酶消化3 d后，再加大氫氧化鉀浸解濃度和雙氧水漂白濃度，以股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚為對象，成功顯示了肉眼可見的整塊皮膚內(nèi)的神經(jīng)分支分布，證實(shí)了本文的假設(shè)。由于皮膚是整塊攤開置于X線閱片箱上，可看見神經(jīng)分支經(jīng)皮下至真皮。真皮內(nèi)以平行走行的次級神經(jīng)分支為主，可見扭曲與打結(jié)走行現(xiàn)象(圖1～4)，這一現(xiàn)象在諸多學(xué)者使用PGP9.5免疫組化染色顯示皮膚內(nèi)神經(jīng)中也有這樣的描述[8,15-16]。本實(shí)驗(yàn)中，為了清晰顯示皮膚內(nèi)細(xì)小神經(jīng)，多數(shù)皮下脂肪被溶解去除，加上許多皮膚內(nèi)神經(jīng)可能直接來源于附近的肌內(nèi)神經(jīng)，導(dǎo)致看見的神經(jīng)分支已經(jīng)是一些真皮內(nèi)的次級神經(jīng)分支，不是皮神經(jīng)干和初級神經(jīng)支，也不是表皮內(nèi)神經(jīng)纖維。因此，本研究按照錢敏、Frahm等[3,8]的方法計(jì)數(shù)真皮內(nèi)神經(jīng)密度。然而，由于目前尚無揭示股前內(nèi)側(cè)區(qū)各個(gè)區(qū)域的真皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度的資料，故本文暫不能與其他研究方法比較真皮內(nèi)神經(jīng)密度是否一致。

本實(shí)驗(yàn)選擇股前內(nèi)側(cè)區(qū)為實(shí)驗(yàn)對象，一方面是因?yàn)樵搮^(qū)域皮膚相對較薄，染色后可獲得的成功幾率高；另一方面，人們越來越注重感覺功能重建，尤其是對皮瓣修復(fù)創(chuàng)面特殊感覺功能恢復(fù)要求較高的部位，如手、口腔、足、陰莖及乳房等部位[17-20]。再一方面，可作為皮膚活檢診斷小感覺纖維疾病的取材部位[8,21-22]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，股前內(nèi)側(cè)區(qū)外側(cè)部下1/3區(qū)、中間部中1/3區(qū)、內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)的神經(jīng)分布相對密集，提示這些區(qū)域應(yīng)是皮膚移植感覺重建的良好供皮區(qū)和提高皮膚活檢成功率的取材部位，這與盧范等采用顯微解剖皮神經(jīng)后建議選擇的皮瓣移植區(qū)結(jié)論相吻合[23]；整體上看，外側(cè)部上1/3區(qū)神經(jīng)分布最稀疏，內(nèi)側(cè)部下1/3區(qū)最密集，這提示前者最不可取，后者較合適，因?yàn)槠ぐ旯﹨^(qū)感覺神經(jīng)的分布與皮瓣移植時(shí)皮神經(jīng)及其吻合部位的選擇是影響皮瓣感覺恢復(fù)的重要原因[24]，受區(qū)神經(jīng)豐富的，理應(yīng)選擇供區(qū)神經(jīng)豐富的進(jìn)行匹配，多增加神經(jīng)接觸的機(jī)會。然而，外側(cè)部上1/3區(qū)又是臨床常用的皮瓣移植區(qū)，這是否提示了臨床手術(shù)需要重新設(shè)計(jì)皮瓣移植的取材部位，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，希望這些結(jié)果可為皮膚活檢提供參考信息。

總的來說，本研究成功改良Sihler’s肌內(nèi)神經(jīng)染色法顯示了股前內(nèi)側(cè)區(qū)皮膚內(nèi)神經(jīng)的分布模式，能借助肉眼直觀的觀察到該區(qū)域皮膚內(nèi)神經(jīng)密集區(qū)和稀疏區(qū)，是介于大體解剖學(xué)和組織學(xué)的一個(gè)過渡觀察，為臨床皮瓣移植感覺重建的選材匹配、提高該區(qū)域皮膚活檢成功率提供了視覺信息，但皮膚內(nèi)神經(jīng)分布模式未能將皮神經(jīng)干、初級神經(jīng)分支及表皮內(nèi)神經(jīng)纖維一并顯示，這些不足有待于進(jìn)一步改良研究。

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[收稿2017-04-25;修回2017-05-12]

(編輯：王福軍)

Using the modified Sihler's nerve staining technique to show the nerve distribution of anteromedial thigh region skin in humans

ZhangQi1,SunYing1,DuXingzhi1,DengDaijin1,YangShengbo2

(1.Department of Clinical Medicine,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China ；2.Department of Anatomy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To construct visible nerve distribution patterns of anteromedial thigh region in human skin.Methods Twelve sides lower limbs from 6 Chinese adult cadavers were fixed by formaldehyde.The skins of anteromedial thigh region were taken by closing to surface of subcutaneous fat.Then,these skins were defatted with absolute alcohol for 3 days,and were digested with collagenase and pancreatin for 3 days.After that,the nerves in the skins were stained by the modified Sihler’s nerve staining method,and then,the nerve fiber density in skins was counted by photoshop software.Results The modified Sihler's nerve staining method was used to stain the nerves in the skin,the secondary nerve branches in subcutaneous fat and the dermis could be seen by naked eyes,and the distorted and tied nerve shapes and the anastomosis between nerve branches could be observed.The nerve fibers density in upper,middle and lower 1/3 in the lateral,middle and medial parts of anteromedial thigh region were(0.90±0.31,1.46±0.67,1.84±0.67,1.66±0.79,2.77±0.77,2.60±0.78,3.86±1.10,4.99±1.38,6.65±1.39)/cm2,respectively,that is to say,the density in upper 1/3 region of the lateral part was sparsest,and the lower 1/3 region of medial part was densest.Conclusion The nerves in anteromedial thigh region skin stained by modified Sihler's nerve staining method can be clearly seen with naked eyes.These results provide a morphological basis for the selection and matching of sensory reconstruction of skin flap and the improvement of the successful rate of skin biopsy.

Sihler’s nerve staining method； anteromedial thigh region； nerve distribution； skin；human

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：31660294)；貴州省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(NO：201413653033)。

楊勝波，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：骨骼肌與周圍神經(jīng)損傷，E-mail:yangshengbo8205486@163.com。

R322

A

1000-2715(2017)03-0318-05